Name: determining bile duct density in the mouse liver
Uploaded: 2019-04-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver at JoVE.com

המחברים מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) (R01 GM084135 ו R01 DK109982), פרס פיילוט/היתכנות ממרכז הרפואי של טקסס מרכז מחלת העיכול תחת NIH P30 DK56338, ופרס מאיץ של תסמונת אלג'אין . הקרן הרפואית

כל בעלי החיים שוכנו במתקן לבעלי חיים של המכשול בביילור קולג ' לרפואה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והנחיות וועדות שימוש בפרוטוקולים בעלי חיים מאושרים.
1. אוסף של רקמת הכבד של העכבר
<ol><li>
הכנת העכבר לקציר הכבד
	<ol>
<li>המתת החסד של העכבר באמצעות isofלוריאן.</li>
		<li>לבצע נקע בצו?...

<ol>
	<li>Zong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+liver+development+by+regulating+biliary+differentiation.">Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation.</a> Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).</li><li>Clotman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+liver+cell+fate+decision+by+a+gradient+of+TGF&#946;+signaling+modulated+by+Onecut+transcription+factors.">Control of liver cell fate decision by a gradient of TGF&#946; signaling modulated by Onecut transcription factors.</a> Genes &amp; Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).</li><li>Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+etiologies+and+management+of+neonatal+cholestasis.">Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis.</a> Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).</li><li>Roskams, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+the+finer+branches+of+the+biliary+tree:+canals,+ductules,+and+ductular+reactions+in+human+livers.">Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.</a> Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).</li><li>Oda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+human+Jagged1+gene+are+responsible+for+Alagille+syndrome.">Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome.</a> Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alagille+syndrome+is+caused+by+mutations+in+human+Jagged1,+which+encodes+a+ligand+for+Notch1.">Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1.</a> Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+Notch+ligand+Jagged1.">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).</li><li>Hadchouel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paucity+of+interlobular+bile+ducts.">Paucity of interlobular bile ducts.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).</li><li>Emerick, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+Alagille+syndrome+in+92+patients:+frequency+and+relation+to+prognosis.">Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis.</a> Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).</li><li>Poncy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+SOX4+and+SOX9+cooperatively+control+development+of+bile+ducts.">Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts.</a> Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+in+the+portal+vein+mesenchyme+regulates+intrahepatic+bile+duct+development:+insights+into+Alagille+syndrome.">Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome.</a> Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).</li><li>McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Alagille+syndrome:+Notch2+as+a+genetic+modifier+of+Jag1+haploinsufficiency.">A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency.</a> Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+Alagille+Syndrome+and+Mechanisms+of+Jagged1+Missense+Mutations.">Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations.</a> Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).</li><li>Loomes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+duct+proliferation+in+liver-specific+Jag1+conditional+knockout+mice:+effects+of+gene+dosage.">Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage.</a> Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).</li><li>Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+trophectoderm-specific+markers+during+mouse+blastocyst+formation.">Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+against+alpha-smooth+muscle+actin:+a+new+probe+for+smooth+muscle+differentiation.">A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation.</a> J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).</li><li>Kamath, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+to+identify+laboratory+predictors+of+liver+disease+outcome+in+Alagille+syndrome.">A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).</li><li>Mouzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+predictive+markers+of+liver+disease+outcome+in+an+International,+Multicentre+Cohort+of+children+with+Alagille+syndrome.">Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome.</a> Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).</li><li>Shiojiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+bile+ducts+in+the+mammalian+liver.">Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver.</a> Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).</li><li>Crawford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+intrahepatic+biliary+tree.">Development of the intrahepatic biliary tree.</a> Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).</li><li>Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+remodeling+of+the+biliary+architecture+underlies+liver+homeostasis.">Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis.</a> Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).</li><li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGFbeta-mediated+hepatocyte+transdifferentiation.">De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li><li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. (68), e4272 (2012).</li><li>Popper, H., Kent, G., Stein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductular+cell+reaction+in+the+liver+in+hepatic+injury.">Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury.</a> J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).</li><li>Yimlamai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+activity+influences+liver+cell+fate.">Hippo pathway activity influences liver cell fate.</a> Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).</li></ol>

ניתוח של פיתוח BD ותיקון בעכברים הוא כלי חשוב בלימוד פתוגנזה ומנגנון של הפרעות כיס הולסטטי. בנוסף, התפתחות הטיפולים החדשים תלויה בקביעת הפנוטיפים ובהתאם לתהליך המדידה. פנוטיפ הנוכחי במודלים העכבר כרוך בדרך כלל סרום כימיה, היסטולוגיה בכבד וכתמים חיסוני עבור מסוג תא סמנים ספציפיים. למרות טכ...

עץ המרה הוא חלק מכריע בכבד היונקים, ומאפשר למעבר המרה מהפטציטים לבטן. תעלות המרה בתוך הכבד (BDs) נוצרות על ידי המרה, אשר מבדילים בין הפוטנציאל הפוטנציאלי באמצעות חריץ וTGFβ איתות1,2. המפרט הנכון והמחויבות של המרה וההרכבה שלהם לתוך BDs בוגרת הם קריטיים לפיתוח עץ המרה הפנימי של הדלקת הכבד. כמו הכבד גדל במהלך הפיתוח או על התחדשות איברים, מערכת המרה צריך להתפתח לאורך הכבד כדי להבטיח ניקוז המרה תקין. יתר על כן, מספר מחלות syndromic ושאינם סינכדרומית התוצאה בפאולסיטי של BDs3. בנוסף, מספר מחלות הכבד חריפה וכרוניות להצמיח תגובות ductular כביכול בכבד, אשר מוגדרים כנוכחות של מספר משמעותי של תאים המבטאים סמנים המרה אך לא בהכרח נובעים תאי המרה או טופס פטנט BDs4. בתסמונת הפרעת המערכת הולטיסיסטים (algs), הפלוייתת של החריץ ליגjagged1 (JAG1) התוצאות במערך BD עני וכולאוסטזיס5,6. המעבדה שלנו הוכיחה לאחרונה כי שנוצר בעבר Jag1 heterozygous קו7 הוא מודל חיה של BD דלות ב algs8. במודל העכבר הזה של ALGS, האלאנגיוציטים עדיין נוכחים. עם זאת, הם נכשלים להתחייב להתאגדות לתוך בוגרת, פטנט BDs8. לכן, ניתוח של הכבד במודל של BD דלות דורש יותר מאשר נוכחות לכאורה או העדר המרה. חשוב להעריך במדויק את המידה שבה BDs בוגרים נמצאים בכבד.
בפתולוגיה אנאטומית, ישנן שיטות כמותיים מקובלות להערכת האם ה-BD דלות קיים9. לדוגמה, מחקרים על algs בחולים אנושיים לעתים קרובות לכמת את BD כדי וריד הפורטל (PV) יחס על ידי ניתוח לפחות 10 כלי הפורטל לכל כבד ביופסיה9,10. ניתוח של הצורה ואת הנוכחות הכללית או העדר פטנטים BDs, בשילוב עם כימיה סרום, יכול לספק מידע רב ערך על התפתחות BD בעכברים11,12,13. עם זאת, עכברים יכולים לאבד מספר משמעותי של BDs עם עלייה צנועה רק סרום בילירובין רמה8. לפיכך, שיטה כמותית המוערכת את מספר BDs הנוכחי לכל PV יכול לספק מידה ישירה יותר של המידה של BD דלות בעכברים. בדו ח האחרונות, אנו ככמת את מספר BDs לכל PV בכל האונות בכבד ודיווח ירידה משמעותית ביחס BD ל-PV ב Jag1 +/– בעלי חיים8. במהלך הניתוח שלנו, הבחנו כי למרות וריאציה משמעותית בדרגת תגובה דלקתית ותגובות ductular, BD ליחס PV לא להראות ההבדלים הרבה8. יתר על כן, הקוונפיקציה של BD ליחס PV מותר לנו להדגים כי הסרת עותק אחד של הגליסישיאז גן Poglut1 ב Jag1 +/– בעלי חיים יכולים לשפר באופן משמעותי את שלהם BD דלות8. ברקע Jag1 +/+ , אובדן מותנה של Poglut1 בתאי שריר וסקולריים החלקה תוצאות עלייה מתקדמת במספרי BD, אשר צנוע (20-30%) ב-P7 אבל הופך להיות בולט במבוגרים8. שוב, טכניקה זו אפשרה לנו להראות כי אפילו ב P7, הגידול בצפיפות BD בבעלי חיים אלה הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית. של הערה, את צפיפות ה-BD מוגברת ב-גנוטיפ זה בגיל ארבעה חודשים היה מאומת באמצעות ניתוח שחקנים שרף גם. 8 תצפיות אלה ודוחות אחרים שנמדדו צפיפות BD במודלים algs עכבר שונים14,15 בקשה לנו לשלב את השיטה הזו לתוך האסטרטגיה הכוללת שלנו לנתח פגמים במרה במוטציות שונות ועכברים טרנסגניים.
כאן, אנו פירוט טכניקה פשוטה אשר ניתן להשתמש בה כדי לבחון את מידת ה-BD דלות בדגמי העכבר של מחלת הכבד (איור 1). בשיטה זו, שיתוף בשילוב עם סמנים הכולאנציט (CK) 8 ו CK19 (להלן הספקטרום הרחב CK, wsCK) משמש כדי להמחיש BDs ו המרה משולבת בכבד העכבר. נוגדן נגד אקטין שריר החלקה אלפא (αSMA) מתווסף לצביעת כלי התוויות. ניתוח שיטתי של BD ל-PV יחס בסעיף המכסה את כל האונות בכבד מבטיח כי מספר גדול של PVs מנותח עבור כל גנוטיפ. מאז השיטה שלנו מסתמך על ככמת BDs ו PVs ב-2D תמונות, זה לא מתאים ללמוד את ההשפעות של מוטציה נתונה על המבנה התלת-ממדי של עץ המרה או שלמות של תעלות המרה הקטן. עם זאת, הוא מספק אסטרטגיה פשוטה ואובייקטיבית עבור חוקרים להעריך את פיתוח המרה בעכבר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>16-800-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tube</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoChoice</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>H103-4L</td>
			<td>clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnisette Tissue Cassette</td>
			<td>Fisher HealthCare</td>
			<td>15-197-710E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td>Parrafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62528-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM 325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C8H10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Based Antigen Retrieval</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker</td>
			<td>Instant Pot</td>
			<td>Lux Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Pap Pen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I</td>
			<td>Antibody Registry ID AB531826</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-III</td>
			<td>Antibody Registry ID AB2133570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547, Clone 1A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat-Alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-Cy5</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 micro cover glass</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>48393 059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining bile duct density in the mouse liver

העכבר משמש באופן נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מחלות המרה. כדי להעריך את התפתחות ותפקוד של מערכת המרה, טכניקות שונות משמשות, כולל סרום כימיה, ניתוח היסטולוגית, וכתמים חיסוני עבור סמנים ספציפיים. למרות טכניקות אלה יכול לספק מידע חשוב על מערכת המרה, הם לעתים קרובות לא מציגים תמונה מלאה של צינור המרה (BD) מומים התפתחותיים על פני הכבד כולו. זה חלק בשל היכולת האיתנה של כבד העכבר כדי לנקז את המרה אפילו בבעלי חיים עם ליקוי משמעותי בפיתוח המרה. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה כדי לחשב את המספר הממוצע של BDs המשויכים כל וריד הפורטל (PV) בסעיפים המכסים את כל האונות של עכברים מוטציה/טרנסגניים. בשיטה זו, כבדים מורכבים ומנות בצורה סטריאוטימית כדי להקל על השוואה בין גנוטיפים שונים ותנאים ניסיוניים. BDs מזוהים באמצעות מיקרוסקופ קל של מיקרוקרטין ויטראז ', ולאחר מכן נספר ומחולק על ידי המספר הכולל של PVs להציג באזור הכבד. לדוגמה, אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה להבחין בבירור בין עכברים מסוג פראי לבין מודל עכבר של תסמונת אלאלאין. השיטה המוצגת כאן אינה יכולה להיות מחליפה לטכניקות המבראות את המבנה התלת-מימדי של עץ המרה. עם זאת, הוא מציע דרך קלה וישירה כדי לאמוד את פיתוח BD להעריך את מידת היווצרות התגובה ductular בעכברים.

בעבר תועדו פגמים המרה ב Jag1 +/– בעלי חיים, מודל העכבר של algs8. כדי לקבוע את היחס BD ל-PV, שP30 מנות כבדי העכבר ומוכתמות במשותף עבור CK8 ו CK19 (wsCK) יחד עם סמן כלי הדם αSMA. לאחר מכן אנו מ, לאחר מכן את כל PVs כל האונות בכבד. כפי שמוצג באיור 2A, הגדרתי pvs כמו כלי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver at JoVE.com

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

אנו מציגים שיטה פשוטה למדי ורגיש לקוונפיקציה מדויקת של צפיפות צינור המרה בכבד העכבר. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת ההשפעות של מכפילי גנטי וסביבתי ואת האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים מודלים העכבר של מחלות המרה.

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקר לכמת פיתוח צינור המרה במודלים של עכברים של מחלת כבד. זה גם מאפשר להעריך את ההשפעות של מגבילים גנטיים על התפתחות צינור המרה. היתרון של טכניקה זו הוא שזו שיטה פשוטה, רגישה וכמותית להערכה ישירה של פיתוח צינור המרה.כדי להתחיל, עם העור מוחזק מתוח על ידי מטלאים, להשתמש במספריים קטנים כדי להפוך חתך רוחבי כ סנטימטר אחד מתחת לכלוב הצלעות של עכבר המתת דם. לחשוף את כל פני הגחון של הכבד. השתמש מספריים קטנים לחתוך בזהירות דרך הרצועות המחברות את הכבד לאיברים אחרים בבטן.לאחר מכן, לחתוך דרך צינור המרה המשותף כדי לנתק את הכבד מהמעי. להחזיק את כיס המרה בזהירות להסיר את הכבד. מיד מניחים אותו בצינור 50 מיליליטר מלא שלושה רבעים עם 4% paraformaldehyde.כדי לתקן את רקמת הכבד, הדגירה אותו ב 4% PFA בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לאחר סדרה של שטיפות אתנול, לשטוף את הכבד עם סוכן ניקוי שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל להטביע, לשטוף קלטת רקמה בתבנית רקמה שלוש פעמים במשך 30 דקות שעווה פרפין שחומם מראש ל 60 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, למלא את עובש הרקמה עם שעווה פרפין לגובה שלושה רבעים ולשמור אותו על בלוק חימום ב 60 מעלות צלזיוס. מניחים את הכבד בתבנית עם הצד הגחון פונה כלפי מעלה. לאחר הסרת התבנית בזהירות מבלוק החימום, מניחים את החלק העליון של הקלטת על התבנית.למעלה עם פרפין נוזלי חם ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לילה. לאחר הסרת בלוק הכבד מהתבנית, השתמש במיקרוטום כדי להתחיל לחיתוך דרך הצד הגבי השטחי של הכבד, מה שהופך חמישה מקטעי מיקרומטר. בדוק את החלקים השטחיים תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שהקטעים אינם מקופלים או מקופלים.כדי לעבד שקופיות עבור אימונוהיסטוכימיה, בחר שקופית אחת לכל גנוטיפ כדי לנתח ולשטוף אותו במשך 15 דקות ב xylene, 100%אתנול, 95%אתנול ולבסוף, 70%אתנול. לאחר שטיפת המגלשה במים היונים, טובלים אותה בתווית אחזור אנטיגן גבוהה מבוססת טריס. לאחר מכן, מחממים אותו תחת לחץ בתוך סיר לחץ במשך שלוש דקות ב 10 ק"ג לאינץ 'מרובע.לאחר מתן אפשרות לשקופית להתקרר לטמפרטורת החדר, השתמש בעט PAP כדי לחלק לרמות את המקטעים בשקופית. לאחר שטיפה עם PBS Tween, לחסום את חלקי הרקמה על ידי הוספת 100 microliters של פתרון חסימה לכל סעיף דגירה מכוסה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. החל 100 microliters של פתרון נוגדנים מדולל המכיל את כל שלושת הנוגדנים העיקריים לכל סעיף וולדגר אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה.לאחר שטיפת המגלשות, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תותר הנוגדנים המשני המכיל נוגדנים משניים ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לבסוף, החל מדיום הרכבה וכיסוי על השקופיות. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצלם תמונות 20x בזום 1x של כל מקטע.ודא כי כל וריד פורטל על פני הכבד הוא בתמונה. צור גיליון אלקטרוני עם העמודות הבאות:מספר בעלי חיים/מדגם, מספר תמונה, מספר ורידי הפורטל ומספר צינורות המרה. זהה ורשם את מספר ורידי הפורטל לתמונה עבור כל תמונה.לאחר מכן, לזהות צינורות מרה פטנט בכל תמונה, על ידי נוכחות של cholangiocytes המקיף לומן מוגדר. מבנים אלה צריכים להיות מובחנים ומופרדים על ידי mesenchyme מתאים אחרים ספקטרום רחב cytokeratin חיובי. אחד האתגרים העיקריים של טכניקה זו הוא בזיהוי תעלות מרה פטנט.קביעת מהו צינור פטנט דורשת ניתוח של צורת הצינור והתאים המקיפים את הלומן. ספור כל צינור מרה של פטנט והצב אותו באותה עמודה כמו מספר התמונה וחזור על הפעולה עבור כל תמונת וריד פורטל. לבסוף, לחשב את הסכום של כל ורידים פורטל וכל צינורות המרה בדגימה הכבד ולחשב את צינור המרה יחס וריד הפורטל עבור דגימת הכבד.כבדי עכבר P30 נותקו והוכתימו במשותף עבור CK8 ו- CK19 יחד עם סמן כלי הדם, אלפא-SMA, כדי לקבוע את יחס BD ל- PV. כאשר כל ורידי הפורטל בכל אונת כבד הם בתמונה, ורידים פורטל הוגדרו כלי מוכתמים אלפא-SMA כי יש סמוך ספקטרום רחב כתם cytokeratin. מבני הכתמים אלפא-SMA ללא ציטוקראטין ספקטרום רחב היו ורידים מרכזיים אשר הוצאו מהניתוח.תעלות פטנט יש לומן מוגדר בבירור כי הוא מוקף ציטוקרטין ספקטרום רחב חיובי cholangioctyes והם מופרדים בדרך כלל מן התעלות הסמוכות או cholangiocytes על ידי mesenchyme. תאים חיוביים cytokeratin ספקטרום רחב כי אין לומן מוגדר, אינם נספרים לקראת המספר הכולל של צינורות מרה. קטע כבד מבעל חיים מסוג בר מראה וריד פורטל הקשורים צינור פטנט מלא יחד עם מספר תאים מאוגדים.קטע כבד נציג מבעל חיים הטרוזיגוס JAG1 מראה שאין תעלות מרה פטנט נמצאים סביב שלושת ורידים פורטל. כל התאים החיוביים של ציטוקרטין בספקטרום רחב כאן אינם מאוגדים ולכן אין לספור אותם. ניתוח יחס BD ל- PV עבור שלושה סוגים פראיים ושלושה בעלי חיים הטרוזיגים JAG1 מראה כיצד ניתן להבדיל בין שני הגנוטיפים בקלות בהתבסס על ספירת צינור המרה.חשוב להעריך את כל כלי הפורטל עבור צינורות מרה. זה קריטי במיוחד לקביעת צפיפות צינור המרה אם יש שונות פנוטיפית על פני הכבד. טכניקה זו שימשה לזיהוי מדכא גנטי של פנוטיפ המרה במודל העכבר של הלגסון.לכן, זה עשוי להיות שימושי בהערכת מודלים טיפוליים של מודלים של בעלי חיים של מחלת מרה.

determining-bile-duct-density-in-the-mouse-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

גירוי של מערכת איתות Notch עכבר osteoclast המבשר

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

שימוש הרומן של בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה תלת מימדי אפיון בתחילת ההריון העכבר

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

מודל אנושי העכבר Chimeric הכבד היפרכולסטרולמיה משפחתית באמצעות Hepatocytes נגזר תאי גזע Pluripotent המושרה

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...