Name: determining bile duct density in the mouse liver
Uploaded: 2019-04-30T14:45:00
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Gli autori riconoscono il sostegno del National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 e R01 DK109982), un Pilot/Feasibility Award del Texas Medical Center Digestive Disease Center sotto NIH P30 DK56338, e un Alagille Syndrome Accelerator Award da La Fondazione Medica.

Tutti gli animali sono stati alloggiati in una struttura per animali barriera presso il Baylor College of Medicine per le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e con protocolli animali approvati.
1. Collezione di tessuto epatico del topo
<ol><li>
Preparazione del topo per la raccolta del fegato
	<ol>
<li>Eutanasia il topo usando l'isoflurane.</li>
		<li>Eseguire lussazione cervicale del topo per garantire la morte.</li>
		<li>Fare un'incisi...

<ol>
	<li>Zong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+liver+development+by+regulating+biliary+differentiation.">Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation.</a> Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).</li><li>Clotman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+liver+cell+fate+decision+by+a+gradient+of+TGF&#946;+signaling+modulated+by+Onecut+transcription+factors.">Control of liver cell fate decision by a gradient of TGF&#946; signaling modulated by Onecut transcription factors.</a> Genes &amp; Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).</li><li>Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+etiologies+and+management+of+neonatal+cholestasis.">Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis.</a> Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).</li><li>Roskams, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+the+finer+branches+of+the+biliary+tree:+canals,+ductules,+and+ductular+reactions+in+human+livers.">Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.</a> Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).</li><li>Oda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+human+Jagged1+gene+are+responsible+for+Alagille+syndrome.">Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome.</a> Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alagille+syndrome+is+caused+by+mutations+in+human+Jagged1,+which+encodes+a+ligand+for+Notch1.">Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1.</a> Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+Notch+ligand+Jagged1.">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).</li><li>Hadchouel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paucity+of+interlobular+bile+ducts.">Paucity of interlobular bile ducts.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).</li><li>Emerick, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+Alagille+syndrome+in+92+patients:+frequency+and+relation+to+prognosis.">Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis.</a> Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).</li><li>Poncy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+SOX4+and+SOX9+cooperatively+control+development+of+bile+ducts.">Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts.</a> Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+in+the+portal+vein+mesenchyme+regulates+intrahepatic+bile+duct+development:+insights+into+Alagille+syndrome.">Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome.</a> Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).</li><li>McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Alagille+syndrome:+Notch2+as+a+genetic+modifier+of+Jag1+haploinsufficiency.">A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency.</a> Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+Alagille+Syndrome+and+Mechanisms+of+Jagged1+Missense+Mutations.">Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations.</a> Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).</li><li>Loomes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+duct+proliferation+in+liver-specific+Jag1+conditional+knockout+mice:+effects+of+gene+dosage.">Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage.</a> Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).</li><li>Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+trophectoderm-specific+markers+during+mouse+blastocyst+formation.">Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+against+alpha-smooth+muscle+actin:+a+new+probe+for+smooth+muscle+differentiation.">A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation.</a> J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).</li><li>Kamath, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+to+identify+laboratory+predictors+of+liver+disease+outcome+in+Alagille+syndrome.">A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).</li><li>Mouzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+predictive+markers+of+liver+disease+outcome+in+an+International,+Multicentre+Cohort+of+children+with+Alagille+syndrome.">Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome.</a> Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).</li><li>Shiojiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+bile+ducts+in+the+mammalian+liver.">Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver.</a> Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).</li><li>Crawford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+intrahepatic+biliary+tree.">Development of the intrahepatic biliary tree.</a> Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).</li><li>Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+remodeling+of+the+biliary+architecture+underlies+liver+homeostasis.">Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis.</a> Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).</li><li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGFbeta-mediated+hepatocyte+transdifferentiation.">De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li><li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. (68), e4272 (2012).</li><li>Popper, H., Kent, G., Stein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductular+cell+reaction+in+the+liver+in+hepatic+injury.">Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury.</a> J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).</li><li>Yimlamai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+activity+influences+liver+cell+fate.">Hippo pathway activity influences liver cell fate.</a> Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).</li></ol>

L'analisi dello sviluppo e della riparazione di BD nei topi è uno strumento importante per studiare la patogenesi e il meccanismo dei disturbi colestatici. Inoltre, lo sviluppo di nuove terapie dipende in parte dalla creazione di un fenotipo riproducibile e preferibilmente quantificabile. L'attuale fenotipizzazione nei modelli murini di solito coinvolge la chimica del siero, l'istologia del fegato e l'immunostaining per marcatori specifici di tipo cellulare. Sebbene queste tecniche generino informazioni preziose sulla s...

L'albero biliare è una parte critica del fegato dei mammiferi, permettendo il passaggio della bile dagli epatociti nell'intestino. I dotti biliari intraepatici (BD) sono formati da cholangiociti, che si differenziano dagli epatoblasti bipotenziali attraverso la segnalazione di Notch e TGF Una corretta specificazione e impegno dei cholangiocyti e del loro assemblaggio in BD maturi sono fondamentali per lo sviluppo dell'albero biliare intraepatico. Come il fegato cresce durante lo sviluppo o sulla rigenerazione dell'organo, il sistema biliare ha bisogno di sviluppare lungo il fegato per garantire il corretto drenaggio della bile. Inoltre, un certo numero di malattie sindromiche e non sindromiche si traducono nella scarsità di BD intraepatici3 . Inoltre, una serie di malattie acute e croniche del fegato danno origine alle cosiddette reazioni dudulle nel fegato, che sono definite come la presenza di un numero significativo di cellule che esprimono marcatori biliari ma non derivano necessariamente da cellule biliari o forme brevetto BD4. Nel disturbo multisistema la sindrome di Alagille (ALGS), aploinsufficienza del ligando di Notch(JAG1) provoca scarsa formazione di BD e colestasi5,6. Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che una lineadi mouse Jag1 eterozygous generata in precedenza è un modello animale di paucedia BD in ALGS8. In questo modello di topo di ALGS, i cholangiocytes sono ancora presenti. Tuttavia, non riescono a impegnarsi nell'incorporazione in maturi, brevetti BD8. Pertanto, l'analisi del fegato in un modello di paucity BD richiede più della presenza apparente o assenza di colgaliociti. È importante valutare con precisione il grado di presenza di BD maturi nel fegato.
Nella patologia anatomica, ci sono metodi quantitativi accettati per valutare se la paucity BD esiste9. Ad esempio, gli studi su ALGS su pazienti umani spesso quantificano il rapporto BD-vina porta (PV) analizzando almeno 10 vasi portali per biopsia epatica9,10. L'analisi della forma e la presenza complessiva o l'assenza di BD brevettati, combinati con la chimica del siero, possono fornire preziose informazioni sullo sviluppo di BD nei topi11,12,13. Tuttavia, i topi possono perdere un numero significativo di BD con solo un modesto aumento del livello biliarina del siero8. Di conseguenza, un metodo quantitativo che valuta il numero di BD presenti per fotovoltaico può fornire una misura più diretta del grado di scarsità di BD nei topi. In un recente rapporto, abbiamo quantificato il numero di BD per FOTO in tutti i lobi epatici e segnalato una significativa diminuzione del rapporto BD-PV in Jag1/– animali8. Nel corso della nostra analisi, abbiamo notato che, nonostante la variazione significativa nel grado di risposta infiammatoria e reazioni dudulare, il rapporto BD-PV non mostra molta variabilità8. Inoltre, la quantificazione del rapporto BD-PV ci ha permesso di dimostrare che la rimozione di una copia del gene glicosiltransferasi Poglut1 in Jag1- / gli animali possono migliorare significativamente la loro scarsità di BD8. In uno sfondo di Jag1/ , la perdita condizionale di Poglut1 nelle cellule muscolari limpiche vascolari si traduce in un aumento progressivo del numero di BD, che è modesto (20-30%) a P7 ma diventa prominente negli adulti8. Anche in questo caso, questa tecnica ci ha permesso di dimostrare che anche a P7, l'aumento della densità di BD in questi animali è statisticamente significativo. Da notare che l'aumento della densità di BD in questo genotipo a quattro mesi di età è stato convalidato anche attraverso l'analisi del getto di resina. 8 Queste osservazioni e altre relazioni che misuravano la densità di BD in diversi modelli murini ALGS14,15 ci hanno spinto a incorporare questo metodo nella nostra strategia complessiva per analizzare i difetti biliari in vari modelli mutanti e topi transgenici.
In questo caso, viene descritta in dettaglio una tecnica semplice che può essere utilizzata per esaminare il grado di scarsità di BD nei modelli murini di malattia epatica (Figura 1). In questo metodo, la co-colorazione con marcatori di colosso ciclica (CK) 8 e CK19 (in seguito ad ampio spettro CK, wsCK) viene utilizzata per visualizzare BD e cholangiocyte non incorporati nel fegato del topo. Un anticorpo contro l'actina muscolare alfa-liscio (SMA) viene aggiunto alla colorazione per etichettare i vasi. L'analisi sistematica del rapporto BD-PV in una sezione che copre tutti i lobi epatici assicura che un gran numero di fotocamere venga analizzato per ogni genotipo. Poiché il nostro metodo si basa sulla quantificazione di BD e PV in immagini 2D, non è adatto per studiare gli effetti di una determinata mutazione sulla struttura 3D dell'albero biliare o sull'integrità dei piccoli condotti biliari. Tuttavia, fornisce una strategia semplice e oggettiva per gli investigatori per valutare lo sviluppo biliare nel mouse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>16-800-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tube</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoChoice</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>H103-4L</td>
			<td>clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnisette Tissue Cassette</td>
			<td>Fisher HealthCare</td>
			<td>15-197-710E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td>Parrafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62528-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM 325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C8H10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Based Antigen Retrieval</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker</td>
			<td>Instant Pot</td>
			<td>Lux Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Pap Pen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I</td>
			<td>Antibody Registry ID AB531826</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-III</td>
			<td>Antibody Registry ID AB2133570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547, Clone 1A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat-Alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-Cy5</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 micro cover glass</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>48393 059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining bile duct density in the mouse liver

Il topo è ampiamente usato come organismo modello per studiare le malattie biliari. Per valutare lo sviluppo e la funzione del sistema biliare, vengono utilizzate varie tecniche, tra cui la chimica del siero, l'analisi istologica e l'immunostaining per marcatori specifici. Anche se queste tecniche possono fornire importanti informazioni sul sistema biliare, spesso non presentano un quadro completo dei difetti dello sviluppo del dotto biliare (BD) in tutto il fegato. Ciò è in parte dovuto alla robusta capacità del fegato di topo di drenare la bile anche negli animali con compromissione significativa nello sviluppo biliare. Qui presentiamo un metodo semplice per calcolare il numero medio di BD associati a ogni vena del portale (PV) in sezioni che coprono tutti i lobi di topi mutanti/transgenici. In questo metodo, i fegati sono montati e sezionato in modo stereotipato per facilitare il confronto tra vari genotipi e condizioni sperimentali. I BD sono identificati tramite microscopia leggera dei cholangiociti macchiati di citokeratina, e quindi contati e divisi per il numero totale di FOTO presenti nella sezione epatica. Ad esempio, mostriamo come questo metodo possa distinguere chiaramente tra topi selvatici e un modello murino della sindrome di Alagille. Il metodo qui presentato non può sostituire le tecniche che visualizzano la struttura tridimensionale dell'albero biliare. Tuttavia, offre un modo semplice e diretto per valutare quantitativamente lo sviluppo della BD e il grado di formazione della reazione dudulare nei topi.

In precedenza abbiamo documentato i difetti biliari negli animali Jag1/– un modello murino di ALGS8. Per determinare il rapporto BD-PV, abbiamo sezionato i fegati di topo P30 e li abbiamo co-macchiati per CK8 e CK19 (wsCK) insieme al marcatore vascolare sMA. Abbiamo poi immaginato tutti i PV in ciascuno dei lobi epatici. Come illustrato nella Figura 2A, abbiamo definito i PV come vasi con colorazione sMA con colorazione wsCK...

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Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Vi presentiamo un metodo piuttosto semplice e sensibile per la quantificazione accurata della densità del condotto biliare nel fegato del topo. Questo metodo può aiutare a determinare gli effetti dei modificatori genetici e ambientali e l'efficacia delle potenziali terapie nei modelli murini delle malattie biliari.

Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Questo protocollo consente allo sperimentatore di quantificare lo sviluppo del condotto biliare nei modelli di topo di malattia epatica. Consente inoltre di valutare gli effetti dei modificatori genetici sullo sviluppo del condotto biliare. Il vantaggio di questa tecnica è che è un metodo semplice, sensibile e quantitativo per la valutazione diretta dello sviluppo del condotto biliare.Per iniziare, con la pelle tenuta tesa dalle forbici, usa piccole forbici per fare un'incisione trasversale circa un pollice sotto la gabbia toracica di un topo eutanasiato. Esporre l'intera superficie ventrale del fegato. Utilizzare piccole forbici per tagliare con cura i legamenti che collegano il fegato agli altri organi dell'addome.Quindi, tagliare attraverso il condotto biliare comune per staccare il fegato dall'intestino. Tenere la cistifellea e rimuovere con cura il fegato. Posizionarlo immediatamente in un tubo da 50 millilitri riempito tre quarti con paraformaldeide al 4%.Per fissare il tessuto epatico, incubarlo in PFA al 4% a quattro gradi Celsius per 48 ore. Dopo una serie di lavaggi di etanolo, lavare il fegato con agente di compensazione tre volte per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Per iniziare l'incorporamento, lavare una cassetta di tessuto in uno stampo tissutale tre volte per 30 minuti in cera di paraffina preriscaldata a 60 gradi Celsius.Quindi, riempire lo stampo di tessuto con cera di paraffina a tre quarti di altezza e tenerlo su un blocco riscaldante a 60 gradi Celsius. Posizionare il fegato nello stampo con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Dopo aver rimosso con cura lo stampo dal blocco riscaldante, posizionare la parte superiore della cassetta sullo stampo.Completa con paraffina liquida calda e lascialo raffreddare a temperatura ambiente durante la notte. Dopo aver rimosso il blocco epatico dallo stampo, utilizzare un microtomo per iniziare a sessare attraverso il lato dorsale superficiale del fegato, facendo cinque sezioni di micrometro. Controllare le sezioni superficiali al microscopio a dissezione per assicurarsi che le sezioni non siano tranciate o piegate.Per elaborare le diapositive per l'immunoistochimica, selezionare una diapositiva per genotipo da analizzare e lavarla per 15 minuti in xilene, 100% etanolo, 95% etanolo e, infine, 70%etanolo. Dopo aver lavato lo scivolo nell'acqua ionizzata, immergerlo nella soluzione di recupero dell'antigene ad alto pH a base di Tris. Quindi, scaldarlo sotto pressione in una pentola a pressione per tre minuti a 10 libbre per pollice quadrato.Dopo aver lasciato raffreddare lo scivolo a temperatura ambiente, utilizzare una penna PAP per delineare le sezioni della diapositiva. Dopo il lavaggio con PBS Tween, bloccare le sezioni tissutali aggiungendo 100 microlitri di soluzione di blocco per sezione e incubare coperti a quattro gradi Celsius per un'ora. Applicare 100 microlitri della soluzione anticorpale diluita contenente tutti e tre gli anticorpi primari su ogni sezione e incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte.Dopo aver lavato le diapositive, aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale secondaria contenente sia anticorpi secondari che incubare per un'ora a temperatura ambiente. Infine, applicare il supporto di montaggio e un coverslip alle diapositive. Usa un microscopio fluorescente per scattare immagini 20x con uno zoom 1x di ogni sezione.Assicurarsi che ogni vena porta attraverso il fegato sia immagine. Creare un foglio di calcolo con le colonne seguenti:Numero animale/campione, Numero di immagine, numero di vene del portale e numero di dotti biliari. Identificare e registrare il numero di vene portale per immagine per ogni immagine.Quindi, identificare i dotti biliari brevettati in ogni immagine, dalla presenza di conlangiociti che circondano un lume definibile. Queste strutture dovrebbero essere distinte e separate dal mesenchima da altre cellule positive alla citocheratina ad ampio spettro. Una sfida principale di questa tecnica consiste nell'identificare i dotti biliari brevettati.Determinare cos'è un condotto brevettato richiede un'analisi della forma del condotto e delle cellule che circondano il lume. Contare ogni condotto biliare brevettato e posizionarlo nella stessa colonna del numero di immagine e ripetere per ogni immagine della vena del portale. Infine, calcola la somma di tutte le vene portale e di tutti i dotti biliari nel campione di fegato e calcola il rapporto bile condotto/vena portale per il campione di fegato.I fegati del topo P30 sono stati sesati e co-macchiati per CK8 e CK19 insieme al marcatore vascolare, alfa-SMA, per determinare il rapporto BD-PV. Quando tutte le vene portale in ogni lobo epatico sono state immagini, le vene portale sono state definite come vasi macchiati alfa-SMA che hanno una colorazione adiacente della citocheratina ad ampio spettro. Le strutture di macchie alfa-SMA senza citocheratina ad ampio spettro erano vene centrali che sono state escluse dall'analisi.I condotti dei brevetti hanno un lume chiaramente definibile che è circondato da cholangioctyes positive alla citocheratina ad ampio spettro e di solito sono separati da condotti o colinogiociti vicini dal mesenchima. Le cellule citocheratina-positive ad ampio spettro che non hanno un lume definibile, non vengono conteggiate per il numero totale di dotti biliari. La sezione epatica di un animale di tipo selvatico mostra una vena portale associata a un condotto completamente brevettato insieme a diverse cellule non incorporate.La sezione epatica rappresentativa di un animale eterozigote JAG1 non mostra che non siano presenti dotti biliari brevettati intorno alle tre vene del portale. Tutte le cellule citocheratine-positive ad ampio spettro qui non sono incorporate e quindi non devono essere conteggiate. L'analisi del rapporto BD/PV per tre animali eterozigoti jag1 mostra come i due genotipi possano essere facilmente distinti in base al numero di dutti biliari.È importante valutare tutte le navi portale per i dotti biliari. È particolarmente importante per determinare la densità del condotto biliare se c'è variabilità fenotipico nel fegato. Questa tecnica è stata utilizzata per identificare un soppressore genetico del fenotipo biliare in un modello di topo di Helgason.Pertanto, può essere utile per valutare le modalità di trattamento dei modelli animali di malattia biliare.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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