Name: determining bile duct density in the mouse liver
Uploaded: 2019-04-30T14:45:00
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Os autores reconhecem o apoio dos institutos nacionais de saúde (NIH) (R01 GM084135 e R01 DK109982), um prêmio de piloto/viabilidade do centro médico do centro de doenças digestivas do Texas NIH p30 DK56338, e um prêmio de acelerador de síndrome de Alagille de A Fundação médica.

Todos os animais foram alojados em uma instalação de barreira animal no Baylor College of Medicine por diretrizes institucionais de cuidado animal e uso do Comitê e protocolos de animais aprovados.
1. coleção do tecido do fígado do rato
<ol><li>
Preparação do rato para a colheita do fígado
	<ol>
<li>Eutanizar o rato usando isoflurano.</li>
		<li>Realize luxação cervical do mouse para garantir a morte.</li>
		<li>Faça uma incisão transversal aproximadamente uma p...

<ol>
	<li>Zong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+liver+development+by+regulating+biliary+differentiation.">Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation.</a> Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).</li><li>Clotman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+liver+cell+fate+decision+by+a+gradient+of+TGF&#946;+signaling+modulated+by+Onecut+transcription+factors.">Control of liver cell fate decision by a gradient of TGF&#946; signaling modulated by Onecut transcription factors.</a> Genes &amp; Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).</li><li>Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+etiologies+and+management+of+neonatal+cholestasis.">Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis.</a> Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).</li><li>Roskams, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+the+finer+branches+of+the+biliary+tree:+canals,+ductules,+and+ductular+reactions+in+human+livers.">Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.</a> Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).</li><li>Oda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+human+Jagged1+gene+are+responsible+for+Alagille+syndrome.">Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome.</a> Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alagille+syndrome+is+caused+by+mutations+in+human+Jagged1,+which+encodes+a+ligand+for+Notch1.">Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1.</a> Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+Notch+ligand+Jagged1.">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).</li><li>Hadchouel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paucity+of+interlobular+bile+ducts.">Paucity of interlobular bile ducts.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).</li><li>Emerick, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+Alagille+syndrome+in+92+patients:+frequency+and+relation+to+prognosis.">Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis.</a> Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).</li><li>Poncy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+SOX4+and+SOX9+cooperatively+control+development+of+bile+ducts.">Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts.</a> Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+in+the+portal+vein+mesenchyme+regulates+intrahepatic+bile+duct+development:+insights+into+Alagille+syndrome.">Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome.</a> Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).</li><li>McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Alagille+syndrome:+Notch2+as+a+genetic+modifier+of+Jag1+haploinsufficiency.">A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency.</a> Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+Alagille+Syndrome+and+Mechanisms+of+Jagged1+Missense+Mutations.">Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations.</a> Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).</li><li>Loomes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+duct+proliferation+in+liver-specific+Jag1+conditional+knockout+mice:+effects+of+gene+dosage.">Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage.</a> Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).</li><li>Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+trophectoderm-specific+markers+during+mouse+blastocyst+formation.">Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+against+alpha-smooth+muscle+actin:+a+new+probe+for+smooth+muscle+differentiation.">A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation.</a> J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).</li><li>Kamath, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+to+identify+laboratory+predictors+of+liver+disease+outcome+in+Alagille+syndrome.">A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).</li><li>Mouzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+predictive+markers+of+liver+disease+outcome+in+an+International,+Multicentre+Cohort+of+children+with+Alagille+syndrome.">Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome.</a> Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).</li><li>Shiojiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+bile+ducts+in+the+mammalian+liver.">Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver.</a> Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).</li><li>Crawford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+intrahepatic+biliary+tree.">Development of the intrahepatic biliary tree.</a> Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).</li><li>Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+remodeling+of+the+biliary+architecture+underlies+liver+homeostasis.">Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis.</a> Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).</li><li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGFbeta-mediated+hepatocyte+transdifferentiation.">De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li><li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. (68), e4272 (2012).</li><li>Popper, H., Kent, G., Stein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductular+cell+reaction+in+the+liver+in+hepatic+injury.">Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury.</a> J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).</li><li>Yimlamai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+activity+influences+liver+cell+fate.">Hippo pathway activity influences liver cell fate.</a> Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).</li></ol>

A análise do desenvolvimento e reparo da BD em camundongos é uma importante ferramenta para estudar a patogênese e o mecanismo de distúrbios colestáticos. Além, o desenvolvimento de terapias novas é na parte dependente em cima de estabelecer um phenotype reprodutível e preferivelmente quantificáveis. A fenotipagem atual em modelos de mouse geralmente envolve química sérica, histologia hepática e imunocoloração para marcadores específicos do tipo celular. Embora essas técnicas gerem informações valiosas ...

A árvore biliar é uma parte crítica do fígado de mamíferos, permitindo a passagem da bile de hepatócitos para o intestino. Os ductos biliares intrahepáticos (BDS) são formados por colangiócitos, que se diferenciam dos hepatoblastos bipotenciais através da sinalização de entalhe e TGFβ1,2. A especificação e o compromisso apropriados dos colangiócitos e de seu conjunto em BDS maduros são críticos para o desenvolvimento da árvore biliar intrahepatic. Como o fígado cresce durante o desenvolvimento ou após a regeneração de órgãos, o sistema biliar precisa se desenvolver ao longo do fígado para garantir a drenagem biliar adequada. Além disso, um número de doenças sindrômica e não-sindrômica resultam no escassez de BDS intrahepatic3. Além disso, uma série de doenças hepáticas agudas e crônicas dão origem às chamadas reações ductulares no fígado, que são definidas como a presença de um número significativo de células que expressam marcadores biliares, mas não necessariamente surgem de células biliares ou forma patente BDs4. Na síndrome de Alagille do transtorno multisistema (algs), a haploinsuficiência do entalhe ligante jagged1 (JAG1) resulta em má formação de BD e colestase5,6. Nosso laboratório demonstrou recentemente que uma linha Jag1 heterozygous previamente gerada7 do rato é um modelo animal de BD escassez em algs8. Neste modelo do rato de algs, os colangiócitos estão ainda atuais. No entanto, eles não conseguem se comprometer com a incorporação em maduro, patentes BDs8. Conseqüentemente, a análise do fígado em um modelo de BD escassez exige mais do que a presença ou a ausência aparente de cholangiocytes. É importante avaliar com precisão o grau em que os BDs maduros estão presentes no fígado.
Na patologia anatômica, existem métodos quantitativos aceitos para avaliar se a BD escassez existe9. Por exemplo, estudos sobre algs em pacientes humanos frequentemente quantificam a razão BD para veia porta (PV) analisando pelo menos 10 vasos portais por biópsia hepática9,10. A análise da forma e a presença ou ausência geral de BDS de patentes, combinadas com a química sérica, podem fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de BD em camundongos11,12,13. No entanto, os camundongos podem perder um número significativo de BDs com apenas um aumento modesto no nível de bilirrubina sérica8. Assim, um método quantitativo que avalia o número de BDS presentes por PV pode fornecer uma medida mais direta do grau de BD escassez em camundongos. Em um relatório recente, nós quantificamos o número de BDs por o picovolt através de todos os lóbulos do fígado e relatamos uma diminuição significativa na relação do BD ao picovolt em Jag1 +/- animais8. No decorrer de nossa análise, observamos que, apesar da significativa variação do grau de resposta inflamatória e das reações ductulares, a relação BD com PV não mostra muita variabilidade8. Além disso, a quantificação da relação BD para PV permitiu demonstrar que a remoção de uma cópia do gene glicosiltransferase Poglut1 em Jag1 +/– animais pode melhorar significativamente a sua BD escassez8. Em um fundo Jag1 +/+ , a perda condicional de Poglut1 em células musculares lisas vasculares resulta em um aumento progressivo nos números de BD, o que é modesto (20-30%) no P7, mas torna-se proeminente em adultos8. Mais uma vez, esta técnica permitiu-nos mostrar que, mesmo em P7, o aumento da densidade de BD nesses animais é estatisticamente significante. Da nota, a densidade aumentada do BD neste genótipo em quatro meses da idade foi validada com a análise do molde da resina também. 8 estas observações e outros relatórios que mediram a densidade do BD em modelos diferentes do rato de algs14,15 alertaram-nos incorporar este método em nossa estratégia total para analisar defeitos biliares em vários mutantes e camundongos transgênicos.
Aqui, detalhamos uma técnica direta que pode ser usada para examinar o grau de BD escassez em modelos de camundongo de doença hepática (Figura 1). Neste método, a cocoloração com marcadores de colangiócitos citoqueratina (CK) 8 e CK19 (a seguir CK de largo espectro, wsCK) é usada para visualizar BDs e colangiócitos não incorporados no fígado do mouse. Um anticorpo de encontro ao actínio alfa-liso do músculo (αSMA) é adicionado à mancha para etiquetar embarcações. A análise sistemática da relação BD para PV em uma seção que abrange todos os lóbulos hepáticos assegura que um grande número de PVs seja analisado para cada genótipo. Como nosso método depende da quantificação de BDs e PVs em imagens 2D, não é adequado para estudar os efeitos de uma determinada mutação na estrutura 3D da árvore biliar ou a integridade das pequenas condutas biliares. Não obstante, fornece uma estratégia simples e objetiva para que os investigadores avaliem o desenvolvimento biliar no rato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>16-800-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tube</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoChoice</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>H103-4L</td>
			<td>clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnisette Tissue Cassette</td>
			<td>Fisher HealthCare</td>
			<td>15-197-710E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td>Parrafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62528-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM 325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C8H10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Based Antigen Retrieval</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker</td>
			<td>Instant Pot</td>
			<td>Lux Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Pap Pen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I</td>
			<td>Antibody Registry ID AB531826</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-III</td>
			<td>Antibody Registry ID AB2133570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547, Clone 1A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat-Alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-Cy5</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 micro cover glass</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>48393 059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining bile duct density in the mouse liver

O rato é amplamente utilizado como um organismo modelo para estudar as doenças biliares. Para avaliar o desenvolvimento e a função do sistema biliar, diversas técnicas são usadas, incluindo a química do soro, a análise histológica, e a imunomarcação para marcadores específicos. Embora essas técnicas possam fornecer informações importantes sobre o sistema biliar, muitas vezes não apresentam um quadro completo de defeitos de desenvolvimento do ducto biliar (BD) em todo o fígado. Isto é em parte devido à habilidade robusta do fígado do rato para drenar a bilis mesmo nos animais com prejuízo significativo no desenvolvimento biliar. Aqui nós apresentamos um método simples para calcular o número médio de BDs associados com cada veia portal (picovolt) nas seções que cobrem todos os lóbulos de ratos mutantes/transgenic. Neste método, os fígados são montados e seccionados de forma estereotipado para facilitar a comparação entre vários genótipos e condições experimentais. Os BDs são identificados por meio de microscopia de luz de colangiócitos corados por citoqueratina e, em seguida, contados e divididos pelo número total de PVs presentes na seção hepática. Como exemplo, mostramos como esse método pode distinguir claramente entre camundongos de tipo selvagem e um modelo de rato da síndrome de Alagille. O método aqui apresentado não pode substituir técnicas que visualizem a estrutura tridimensional da árvore biliar. No entanto, oferece uma maneira fácil e direta de avaliar quantitativamente o desenvolvimento de BD e o grau de formação de reação ductular em camundongos.

Nós documentamos previamente defeitos biliares em Jag1 +/- Animals, um modelo do rato de algs8. Para determinar a relação BD com PV, nós seccionamos os fígados do mouse p30 e os cortinos para CK8 e CK19 (wsCK), juntamente com o marcador vascular αSMA. Nós então imaged todos os PVs em cada um dos lóbulos do fígado. Como mostrado na Figura 2a, definimos PVS como vasos manchados de αsma que têm coloração de wsck adj...

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Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Nós apresentamos um método rather simples e sensível para a quantificação exata da densidade do colagogo no fígado do rato. Este método pode ajudar a determinar os efeitos dos modificadores genéticos e ambientais e a eficácia de terapias potenciais em modelos de camundongo de doenças biliares.

Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Este protocolo permite ao pesquisador quantificar o desenvolvimento de ductos biliares em modelos de camundongos de doença hepática. Também permite avaliar os efeitos dos modificadores genéticos no desenvolvimento do ducto biliar. A vantagem dessa técnica é que é um método simples, sensível e quantitativo para a avaliação direta do desenvolvimento do ducto biliar.Para começar, com a pele esticada por fórceps, use uma pequena tesoura para fazer uma incisão transversal aproximadamente uma polegada abaixo da caixa torácica de um rato eutanizado. Exponha toda a superfície ventral do fígado. Use uma tesoura pequena para cortar cuidadosamente os ligamentos que ligam o fígado aos outros órgãos do abdômen.Em seguida, corte o ducto biliar comum para separar o fígado do intestino. Segure-se na vesícula biliar e remova cuidadosamente o fígado. Coloque-o imediatamente em um tubo de 50 mililitros preenchido três quartos com 4% de paraformaldeído.Para consertar o tecido hepático, incuba-o em 4% PFA a quatro graus Celsius por 48 horas. Depois de uma série de lavagem de etanol, lave o fígado com agente de compensação três vezes por 30 minutos cada um em temperatura ambiente. Para começar a incorporar, lave uma fita de tecido em um molde de tecido três vezes por 30 minutos em cera de parafina pré-superaquecida a 60 graus Celsius.Em seguida, encha o molde de tecido com cera de parafina a três quartos de altura e mantenha-o em um bloco de aquecimento a 60 graus Celsius. Coloque o fígado no molde com o lado ventral voltado para cima. Depois de remover cuidadosamente o molde do bloco de aquecimento, coloque a parte superior do no molde.Cubra com parafina líquida quente e deixe esfriar à temperatura ambiente durante a noite. Depois de remover o bloco hepático do molde, use um microtome para começar a se separar pelo lado dorsal superficial do fígado, fazendo cinco seções de micrômetros. Verifique as seções superficiais sob um microscópio de dissecção para garantir que as seções não sejam tesouradas ou dobradas.Para processar slides para imunohistoquímica, selecione um slide por genótipo para ser analisado e lave-o por 15 minutos em xileno, 100% etanol, 95% etanol e, finalmente, 70% etanol. Depois de lavar o slide na água ionizada, mergulhe-o na solução de recuperação de antígeno de pH à base de Tris. Em seguida, aqueça-o sob pressão em uma panela de pressão por três minutos a 10 libras por polegada quadrada.Depois de deixar o slide esfriar até a temperatura ambiente, use uma caneta PAP para delinear as seções no slide. Depois de lavar com PBS Tween, bloqueie as seções teciduais adicionando 100 microliters de solução de bloqueio por seção e incubar coberto a quatro graus Celsius por uma hora. Aplique 100 microlitadores da solução de anticorpos diluídos contendo todos os três anticorpos primários em cada seção e incuba-os a quatro graus Celsius durante a noite.Após lavar as lâminas, adicione 100 microliters da solução de anticorpos secundários contendo anticorpos secundários e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Por último, aplique meio de montagem e uma mancha de cobertura nos slides. Use um microscópio fluorescente para tirar imagens de 20x a 1x de zoom de cada seção.Certifique-se de que todas as veias do portal através do fígado são imagens. Crie uma planilha com as seguintes colunas:Número de animais/amostra, número da imagem, número de veias do portal e número de dutos biliares. Identifique e regise o número de veias do portal por imagem para cada imagem.Em seguida, identifique os dutos biliares patenteados em cada imagem, pela presença de cholangiocitos em torno de um lúmen definível. Essas estruturas devem ser distintas e separadas por mesenquime de outras células citokeratinas de amplo espectro. Um dos principais desafios dessa técnica é identificar dutos biliares de patente.Determinar o que é um duto de patente requer uma análise da forma do duto e das células ao redor do lúmen. Conte cada ducto bile de patente e coloque na mesma coluna do número da imagem e repita para cada imagem venosa do portal. Finalmente, calcule a soma de todas as veias do portal e todos os dutos biliares na amostra hepática e calcule a relação biliar do ducto ao portal para a amostra hepática.Os fígados de camundongos P30 foram seccionados e co-manchados para CK8 e CK19, juntamente com o marcador vascular, alfa-SMA, para determinar a razão BD para PV. Quando todas as veias do portal em cada lobo hepático são imagens, as veias do portal foram definidas como vasos manchados alfa-SMA que têm manchas de citoquenatina de amplo espectro adjacentes. As estruturas de manchas alfa-SMA sem citoquestina de amplo espectro foram veias centrais que foram excluídas da análise.Os dutos de patente têm um lúmen claramente definível que é cercado por colangioctyes citokeratin-positivo de amplo espectro e geralmente são separados de dutos próximos ou cholangiocitos por mesenchyme. Células de citokeratin-positivas de amplo espectro que não têm um lúmen definível, não são contadas para o número total de dutos biliares. A seção hepática de um animal selvagem mostra uma veia portal associada a um duto totalmente patenteado, juntamente com várias células não incorporadas.A seção hepática representativa de um animal heterozigoso JAG1 não mostra que há dutos biliares patenteados ao redor das três veias do portal. Todas as células citokeratine-positivas de amplo espectro aqui não são incorporadas e, portanto, não devem ser contadas. A análise da relação BD para PV para três animais heterozigosos de tipo selvagem e três JAG1 mostra como os dois genótipos podem ser facilmente distinguidos com base na contagem de dutos biliares.É importante avaliar todos os vasos portais para dutos biliares. É especialmente crítico para determinar a densidade do ducto biliar se houver variabilidade fenotípica em todo o fígado. Esta técnica foi usada para identificar um supressor genético do fenótipo biliar em um modelo de rato de Helgason.Portanto, pode ser útil na avaliação de modalidades de tratamento de modelos animais de doença biliar.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Crescimento do folículo pré-antral do Mouse sob microgravidade simulado

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

Quantificando a densidade de ramificação em glândulas mamárias de ratos montadas inteiras usando o método de análise Sholl

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...