Name: isolation of atrial myocytes from adult mice
Uploaded: 2019-07-25T14:00:00
Duration: 8 min 34 s
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这项工作得到加拿大卫生研究院(MOP 93718, 142486)和加拿大心脏和中风基金会对R.A.Rose的运营资助。 H.J.詹森是基拉姆博士后奖学金的获得者。

所有动物程序均获得卡尔加里大学动物护理和使用委员会的批准,并按照加拿大动物护理理事会的指导方针进行。心房肌细胞分离,图像和代表性的结果,下面描述的是从15周大的雄性野生型C57Bl/6小鼠获得。我们经常使用这个协议从野生型小鼠17,18,携带基因突变19,20和小鼠模型的疾病,如慢性高血压6分离心房肌细胞, 14.该协议可以类似地用于雄性或雌性小鼠。我们还利用了这种隔离程序的类似版本,从小鼠心脏17,21,22,23分离出中心结肌细胞。此实验协议的流程图位于图 1中。
1. 准备库存解决方案和设备
<ol><li>根据制造商的说明,通过添加硅胶弹性体来准备 1 个解剖盘。加入足够的硅胶弹性体化合物,覆盖10厘米培养皿的底部,深度为1厘米。允许固化,然后将6个昆虫针插入盘中。 注:这种硅胶解剖盘可以重复使用数月,并在室温下储存。</li>
	<li>准备 3 个火抛光巴斯德移液器,开口为 1 mm(小孔)、3 mm(中孔)或 5 mm(大孔),如图2A所示。要制作这些移液器,对巴斯德移液器进行评分,然后沿乐谱标记捕捉,以产生略大于所需孔径的开口。使用金属文件平滑表面,然后用明火抛光此开口。 注:这将产生一个光滑的,火抛光的边缘与所需的直径的开口。开口没有裂纹和粗糙表面,这一点很重要。这些消防式移液器可在室温下存放,并重复使用数月。</li>
	<li>为 Tyrode 的 pH 6.9 解决方案和 Tyrode 的 pH 7.4 解决方案准备库存解决方案,如表 1中列出的。也准备10 mL每个 1 MMgCl 2, 1 M CaCl2,和 100 mM CaCl2。所有溶液均使用超纯水,在4°C下储存长达2个月。</li>
	<li>如表 2所示,准备 1 L 的经过修改的卡夫-布吕赫 (KB) 解决方案。使用超纯水。将溶液分成20mL等分,在-20°C储存长达2个月。</li>
</ol>2. 为心房肌膜隔离准备解决方案和隔离设置
<ol><li>在 125 mL Erlenmeyer 烧瓶中,使用 1 M CaCl2和 1 M MgCl2库存溶液,在 125 mL Erlenmeyer 烧瓶中制备经过改进的 Tyrode pH 7.4 溶液的 50 mL。将 Erlenmeyer 烧瓶放入 35°C 的水浴中,直到使用,如图2B所示。</li>
	<li>使用 100 mM CaCl2库存溶液,在 50 mL 管中制备经过改进的 Tyrode pH 6.9 溶液,如表 4中所述。此溶液的2.5 mL等液放入三个5 mL圆形底管中。将这些管子放在放置在35°C水浴的电线架中,直到使用,如图2B所示。</li>
	<li>如表5所述,在14 mL圆形底管中制备酶溶液。要制作蛋白酶溶液,每100μL的超纯水加入1毫克蛋白酶。将含有这种酶溶液的管子放入电线架中,在35°C水浴中孵育,直到使用。</li>
	<li>在 35 °C 水浴中解冻一个改性 KB 溶液的等分。将 2.5 mL KB 溶液的 Aliquote 2.5 mL 溶液放入三个 5 mL 圆形底管中,将 2.5 mL 放入 14 mL 圆形底管中。将这些管子放在电线架中,在35°C的水浴中孵育,直到使用,如图2B所示。</li>
	<li>布局解剖板、解剖工具、巴斯德移液器和火抛光移液器,如图2B所示。</li>
</ol>3. 解剖鼠标心房附属件
<ol><li>通过腹内注射向小鼠注射0.2 mL肝素(10 000 USP U/10 mL),等待5分钟吸收。</li>
	<li>将小鼠放入感应室,通过吸入胶质进行麻醉(3-4%)。异二苯和氧气使用麻醉机输送,并清除废麻醉气体。一旦小鼠被麻醉,并且不表现出脚趾捏反射,通过快速宫颈脱位使小鼠安乐死。将鼠标放在纸巾或软木板上,将爪子向下胶带,将鼠标放在原位。</li>
	<li>用70%乙醇润湿老鼠的胸部。使用弯曲的剪刀去除覆盖胸部的毛皮和皮肤。接下来,使用大鼠牙钳抬起胸骨,然后沿着肋骨边缘切开隔膜。使用弯曲的剪刀去除整个肋骨笼,露出心脏。</li>
	<li>要移除心房附属件(右侧或左侧),请使用精细的解剖钳轻轻提起附属件,并用弹簧剪刀将其切掉。立即将心房附属品转移到含有步骤 2.1 中描述的加热改性 Tyrode 的 pH 7.4 溶液的 20 mL 的硅胶涂层解剖盘中。</li>
	<li>将一个解剖销放在心房附属品的开口底部。使用牧场移液器,用加热的改良Tyrode的pH 7.4溶液冲洗盆房以去除血液。沿着心房附属件的顶部和底部边缘切割,打开心房附属件。接下来,将心房附属件的角落向下固定,以创建一个扁平的矩形组织,如图3A所示。</li>
</ol>4. 心房肌细胞的隔离
注:本节中的步骤均以 35°C 执行,管浸入 35°C 水浴中。在圆底管之间转移组织条时要小心,以确保只有组织(而不是溶液)在管之间转移。
<ol><li>使用弹簧剪刀和细钳将心房附属件切成约 8-10 个大小相等的条形(宽度约为 0.7 mm)。心房组织条的一个示例如图3B所示。请注意,条带收缩一旦他们从主组织切割自由。使用小孔防火抛光移液器,将组织条转移到包含步骤 2.2 中描述的加热改性 Tyrode 的 pH 6.9 溶液的第一管中。等待 5 分钟。</li>
	<li>将组织条转移到第二个和第三个圆形底管,其中包含在步骤 2.2 中制备的经过修改的 Tyrode pH 6.9 溶液,使用中孔防火液器清洗组织条。<ol>
<li>要清洗组织条,将 5 mL 圆形底管盖住,然后轻轻反转管 3 次。让组织条沉降到管的底部,然后用介质孔烧抛光移液器将组织条转移到下一个管中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用中孔烧抛光移液器将组织条转移到步骤 2.3 中描述的酶溶液中,并孵育 30 分钟。 注:在酶消化开始时,组织条在旋转后迅速沉降。在大约20分钟的消化,组织条开始漂浮在酶溶液后旋转。在此期间,心房组织条在消化时的外观也会从淡粉色变为白色。</li>
	<li>酶消化后,在步骤 2.4 中制备的 5 mL 圆形底管中使用 2.5 mL KB 溶液进行三次处理。每次清洗时,使用介质孔烧抛光移液器将组织移到下一管之前,轻轻反转管管 3 次。最后洗涤后,将条带转移到含有 2.5 mL KB 溶液的 14 mL 圆形底管中。等待 5 分钟。</li>
	<li>使用宽孔防火移液器轻轻三聚组织 7.5 分钟。这将机械地分离组织条,并产生一个多云的解决方案,充满了单个心房肌细胞。 注:在三聚过程中,组织变白,溶液变浑浊。通过改变从宽孔防火移液器中排出组织条的频率和速度,三聚力应针对个别隔离进行定制。如果三角化太温和,细胞产量将较低,而太苛刻的三聚体会产生许多死细胞。避免气泡,同时进行三角。</li>
	<li>根据实验用细胞的所需密度,用KB溶液填充含有三聚形组织条的14 mL圆形底管,最终体积为7-10 mL。将本管置于室温下 1 小时。在此潜伏期之后,细胞可用于各种实验长达7小时,细胞也可在4°C下储存长达7小时。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channels+in+the+Heart.">Ion Channels in the Heart.</a> Comprehensive Physiology. 5 (3), 1423-1464 (2015).</li><li>Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+electrophysiology+of+atrial+fibrillation+initiation,+maintenance,+and+progression.">Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression.</a> Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).</li><li>Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+persistent+atrial+fibrillation.">Mechanisms of persistent atrial fibrillation.</a> Current Opinion in Cardiology. 29 (1), 20-27 (2014).</li><li>Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+ion-channel+remodeling+in+the+heart:+heart+failure,+myocardial+infarction,+and+atrial+fibrillation.">Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation.</a> Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).</li><li>Jansen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+structure,+function+and+arrhythmogenesis+in+aged+and+frail+mice.">Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice.</a> Scientific Reports. 7, 44336 (2017).</li><li>Jansen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+atrial+electrical+and+structural+remodeling+in+angiotensin+II+mediated+atrial+fibrillation.">Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).</li><li>Nerbonne, J. M., Kass, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+cardiac+repolarization.">Molecular physiology of cardiac repolarization.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1205-1253 (2005).</li><li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+ion+channels.">Cardiac ion channels.</a> Circulalation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li><li>Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+potassium+channel+subtypes:+new+roles+in+repolarization+and+arrhythmia.">Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia.</a> Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).</li><li>Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+time-+and+voltage-dependent+K++currents+in+myocytes+from+left+and+right+atria+of+adult+mice.">Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).</li><li>Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+ionic+mechanism+for+repolarization+differences+between+canine+right+and+left+atrium.">Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium.</a> Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).</li><li>Wirth, K. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natriuretic+peptides+regulate+heart+rate+and+sinoatrial+node+function+by+activating+multiple+natriuretic+peptide+receptors.">Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).</li></ol>

我们的实验室通常使用该协议分离小鼠心房肌细胞,用于贴片-夹子实验,以调查不同形式的心血管疾病、基因突变或药理化合物对心房肌细胞的影响电 生理。尽管高度可重复,但从隔离心房肌细胞获得的数据的质量取决于隔离的质量。此外,在心房肌细胞分离后重新引入钙将导致由于钙悖论16而分离的肌细胞人群的细胞死亡。因此,使用这种方法隔离可行、高质量的心房肌细胞需要在整个隔离过程中在多个点上进行练习和优化。一旦优化,估计使用这种方法分离的总心房肌细胞的70-90%将同时具有耐钙性和棒状。下面将讨论需要最实际练习和优化的步骤。
解剖的速度和效率将对分离细胞的质量产生下游影响。请务必花时间确保所有血液从心房组织中取出,并且组织条被切割到类似大小。它需要大约5分钟来取出心房附属品,将组织切成条状,并将组织条转移到改性Tyrode的pH 6.9溶液的第一管中。但是,如果此步骤时间过长,组织的质量可能会受到损害。
同样重要的是,组织条在隔离和心脏之间被切成均匀的大小。如果组织条太大或太小,或者如果它们在隔离中不均匀,这可能会导致酶消化和三聚体过程中的问题。这是因为小条条将更彻底地消化,大条条将被消化。同样重要的是,要考虑正在研究的基因型和疾病设置,因为心房附属件的大小可能因动物而异。例如,肥大心脏与健康心脏相比,心房附属物更大,因此实验者可以比正常大小的心脏在肥大心脏中切割更多的条。因此,优化切割组织条的大小并将这些尺寸应用于每个心房附属体,将大大提高实验条件之间肌细胞分离的可重复性。
酶消化和机械解散之间的微妙平衡是使用该协议成功分离心房肌细胞的关键。如果在酶消化过程中组织没有充分旋转,单个组织条将倾向于聚集并粘在一起,这将限制酶消化的有效性。如果激动过于频繁或剧烈,这会损害心房组织,这将导致分离不存活的细胞。在三聚过程中,从组织条中分离的分离心房肌细胞的机械分离是使用这种方法分离心房肌细胞的最关键的步骤。如果三角素太温和,细胞产量将较低。另一方面,如果三聚太苛刻,就会分离出大量无法存活的肌细胞,在贴片夹实验中获得的数据质量将受到损害。此外,atria 的组成会影响隔离。例如,如果组织是纤维化的,酶消化和三聚体步骤可能需要修改。因此,在三聚体过程中,花时间发展获得高质量细胞所需的技能非常重要,这些细胞可用于贴片夹实验。
与所有实验技术一样,也有局限性。这项技术需要实践才能重新分离出可行的高质量肌细胞,这反过来又会影响使用这些肌细胞进行的任何实验的可行性。这种方法也是终端和心房肌细胞隔离使用这种方法只能使用当天隔离。我们的实验室在隔离6-7小时内使用细胞。
这种隔离心房心肌细胞的方法有多种应用。例如,可以修改这种方法,以分离心房肌细胞(以及心脏成纤维细胞)与其他物种,包括人类心房组织活检。此外,使用这种块法分离心房肌细胞(与心脏逆行灌注相反)的好处是,它可以被修改,以分离心肌细胞从心脏的其他区域,如中阴度节点或其他特定区域心房心肌,或包括心脏的整个心室区域。我们的实验室使用心房心肌细胞进行贴片夹实验,以测量作用电位和离子电流,尽管这种方法不必局限于此技术。例如,分离的肌细胞可用于研究各种实验环境中钙瞬变和收缩性的改变。心膜心肌细胞也可用于免疫荧光研究,以研究感兴趣的蛋白质或结构的位置。因此,这种方法对于许多可能的应用都是高度通用的。

atria 是心脏的薄壁低压室,接收来自上等和劣质静脉的血液以及肺静脉,是正常心脏生理学中不可或缺的一部分。与心脏的其他区域一样,心房包含许多细胞类型,包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等。心房肌细胞是电兴奋细胞,在通过心脏传导电信号中起着至关重要的作用,从而确保每个心跳1时适当的心房收缩。耳动功能障碍可导致一些心房特异性心律失常,如心房颤动和心房颤动2,3。这些是高度普遍,但缺乏了解,心房心律失常,导致严重的发病率和死亡率。心房颤动可与基因突变有关,与衰老有关,或与后天形式的心脏病有关,包括高血压、心力衰竭和糖尿病2、4、5 ,6.这些条件可以改变心房肌细胞的电特性,可以创建一个基质,增加心律失常1,2的患病率。
耳膜的正常电功能,以及心房心律失常,受心房肌细胞中产生的行动电位(AP)形态的影响。心房AP产生于许多离子电流的活性,包括钠电流(I Na,由NaV1.5通道携带)、L型钙电流(ICa,L,由Cav1.2和CaV1.3通道携带)),和几个钾电流,包括超快延迟整流器钾电流(I Kur,由KV1.5通道携带),瞬态向外钾电流(I到,由 KV4.2 和 KV4.3 携带通道),稳定状态钾电流(IKss,由KV2.1通道携带),和向内整流器钾电流(IK1,由Kir2.1通道携带)1,7, 8.虽然它们在小鼠atria中不起主要作用,但延迟整流器K+电流(IKr和I K)的快速和缓慢成分也有助于某些物种7的AP重极化。一个或多个离子电流的改变可以显著改变心房肌细胞的电特性,这可能导致心房心律失常。例如,INa的减少可以通过降低 AP 上冲程速度来降低整个 Atria 的传导速度。另一方面,减少重极化钾电流或增加ICa,L或后期INa可能导致后脱极化的发展,可以触发在atria1的自发活动, 2,9.
重要的是要认识到,在心房心肌的不同部分,AP形态存在差异,这可能是由于这些基础的子通道的表达或调节的差异。例如,在 AP 持续时间上,左右 atria 之间的差异与 I与当前密度的差异有关,已经很好地描述了 10、11、12、13 。此外,我们最近亦证明,患有慢性高血压的小鼠的左右电重塑模式不同。右心房后壁还包含中心节点,它有自己独特的AP形态和点火模式15。可以使用每个区域的分离肌细胞详细研究肌细胞在癫痫症的每个不同部位的不同性质。
有不同的方法,可以用来分离心房肌细胞为贴片夹电生理学研究16。一种可能性是使用逆行灌注方法,心脏通过主塔进行酶的输送。虽然这是一种可行的方法,但由于心房灌注的不一致,它可以在心房肌细胞质量中产生变异性。我们采用了一种"块状"消化方法,用于分离心房肌细胞,无需逆行灌注心脏。我们的方法结合了酶消化和心房组织的机械分离,持续可靠地产生大量适合贴片夹研究的分离心房肌细胞。当我们使用心房附属组织描述我们的方法时,该方法可用于心房心肌的任何区域(即,右心房或左心房附属物、自由墙、后壁),由调查员选择。这种方法是理想的研究心房肌细胞电生理学在转基因小鼠,在小鼠模型心血管疾病,或研究药理化合物5,6,17的影响,18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N&#39;, N&#39;-tetraacetic acid 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4926-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, &#62; 99%, from microbial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt &#62; 95%, bacterial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4888-500 MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride ReagentPlus, 99.9%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>289329-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide monohydrate &#62; 99.5% trace metals basis</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>562505-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 2</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine anhydrous</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Aspartic acid potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2025-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS002279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid &#62;97.0%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate &#62; 95% (HPLC), powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 10 000 USP units/10mL</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>10750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#62; 99.5% (titration)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate &#62; 99% (HPLC), powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1501-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine &#62; 98% (HPLC), powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7634-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>PX1480-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>PX1565-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus, type XIV, &#62;3.5 units/mg solid, powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride ACS reagent, &#62; 99.0%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>World Precision Instruments Inc</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride &#62; 98% (titration)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of atrial myocytes from adult mice

心房肌细胞的电生理特性对心脏整体功能有重要影响。负责作用电位的基础离子电流的改变可能导致心律失常的亲心律失常基板,如心房颤动,在许多条件和疾病状态中非常普遍。分离成年小鼠心房心肌细胞用于贴片夹实验,极大地促进了我们对健康心房心肌和心房病理生理学设置中细胞电生理学的知识和理解。此外,使用基因小鼠模型的研究已经阐明了大量蛋白质在调节心房电生理学中的作用。在这里,我们提供了一个详细的方案,从成年小鼠的心房附属物分离心肌细胞,使用酶消化和这些组织的机械分离的组合。这种方法一致可靠地产生孤立的心房心肌细胞,然后可用于在贴片夹实验中测量作用电位和离子电流,从而在一些实验条件下测量细胞电生理学特征条件。

使用该协议分离的心房肌细胞,可以使用贴片夹技术来描述这些细胞的电生理特性。KB 溶液中的心房肌细胞的等分可以添加到标准贴片钳装置的录音室中,并超级填充适合实验者希望执行的录制类型的解决方案。使用该协议分离的心房肌细胞最适合在隔离6-7小时内进行电生理学研究。下面介绍了我们实验室的代表性贴片夹数据。
图 4说明了使用上述协议从正常小鼠中分离出心房肌细胞的示例。孤立的心房肌细胞通常长度为100μm,宽度为10μm,具有清晰的条纹。隔离心房肌细胞的电容通常为 40-70 pF。
图5A演示了在当前钳位模式下使用穿孔贴片夹技术记录的心房肌细胞AP示例,正如我们前面描述的6、19、20所述。表6提供了说明典型心房肌细胞AP参数的摘要数据。具体来说,我们提供静息膜电位 (RMP)、最大上冲程速度 (V最大值)、过冲 (OS) 和 AP 持续时间的测量汇总数据,时间为 50%(APD50)、70%(APD70)和 90% (APD90)重新极化时间 (表 6)。AP也可以记录在整个单元配置14中。用于记录 AP 的超液和移液器解决方案可在表 7和表 8中提供。
图 5B显示了在贴片夹技术的整个单元配置中记录的 Na+电流 (INa)的代表性系列。这些电流使用 50 ms 电压夹步在 -100 和 +10 mV 之间记录,保持电位为 -120 mV。我们已经描述了记录INa之前6,14,20的方法和协议。图5B中也给出了INa IV关系的摘要。用于记录 INa的解决方案在表 7和表 8中介绍。
图 5C显示了在贴片夹技术的整个单元配置中记录的具有代表性的 Ca2+电流系列 (ICa,L)。这些电流使用 250 ms 电压夹步在 -60 和 +80 mV 之间记录,保持电位为 -70 mV。可用于测量ICa,L的实验条件先前已经描述了17,18,20。图5C中还给出了一个摘要ICa,L IV关系。用于记录 ICa、L的解决方案可在表 7和表 8中提供。
图 5D显示了在贴片夹技术的整个单元配置中记录的 K+电流 (IK)的代表性系列。这些电流记录从保持电位-80 mV使用500 ms电压夹步之间的-120 mV和+80 mV,正如我们前面描述的6,14 。总 IK的摘要 IV 关系也显示在图 5D中。用于记录 IK的解决方案可在表 7和表 8中找到。
使用这些方法记录AP和离子电流的主要家族,包括Na+、Ca2+和K+电流(如上图所示),允许调查员在过多的实验条件。我们的实验室经常使用这些技术来研究正常小鼠、心脏病小鼠模型和转基因小鼠6、14、17、18的心房肌细胞电生理学。 ,19,20.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59588/59588fig1.jpg"> 图 1:心房肌细胞隔离协议的流程图。使用此协议隔离心房肌细胞的步骤摘要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59588/59588fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59588/59588fig2.jpg"> 图2:心房肌细胞分离的实验设置和解剖工具。(A. 小孔防火抛光移液器,开口直径为 1 毫米(左)用于解剖后组织转移,中型孔火抛光移液器的开口直径为 3 mm(中),用于在解剖过程中转移组织条。隔离,一个大孔火抛光移液器,开口直径5毫米(右)用于消化心房组织的三聚。(B) 心房肌细胞分离的实验设置.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59588/59588fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59588/59588fig3.jpg"> 图3:心房附属解剖的图像。(A). 已切除的心房附属品的代表性明亮场图像切开并固定出来.(B) 心房附属项的代表性明亮场图像切成约0.7毫米宽的组织条。比例尺 = 1 毫米。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59588/59588fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59588/59588fig4.jpg"> 图4:孤立心房肌细胞的图像。(A) 隔离后立即分离的孤立心房肌细胞的光明场图像.刻度条 = 50 μm。(B). 单个孤立的心房肌细胞的光明场图像.刻度条 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59588/59588fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59588/59588fig5.jpg"> 图5:从孤立的心房肌细胞中获得的代表性贴片夹数据。(A. 代表从孤立的心房肌细胞中刺激 AP 录音.AP参数摘要列在表6中。将安霉球B(200μg/mL)添加到移液器溶液中,以渗透细胞膜。(B) 代表 INa录音(左)和摘要 INa IV 曲线(右)来自孤立的心房肌细胞。尼菲迪平(10 μM)被添加到修改的Tyrode的溶液中,以阻止ICa,L在录制INa时。C. 代表 ICa,L录音(左)和摘要 ICa,L IV 曲线(右)从孤立的心房肌细胞。(D). 代表 IK录音(左)和摘要 IK IV 曲线(右)从孤立的心房肌细胞。表7和表8列出了用于记录每种电流的解决方案。摘要IV曲线是从15周大的雄性野生型C57Bl/6小鼠中分离出的10个心房肌细胞的平均值测量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59588/59588fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>股票泰洛德的pH 6.9</td>
			<td>股票泰洛德的pH 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>在 mM 中</td>
			<td>在 mM 中</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>140</td>
			<td>140</td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化钾</td>
			<td>5.4</td>
			<td>5.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>赫佩斯</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>最终卷</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>1 升</td>
		</tr>
<tr>
<td>与 NaOH 的最终 pH</td>
			<td>6.9</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:股票Tyrode的pH 7.4和股票Tyrode的pH6.9解决方案。Tyrode 的库存溶液(pH 7.4 和 pH 6.9)的成分,可提前制成,并在 4°C 下储存长达 2 个月。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>在 mM 中</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-谷氨酸</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-阿斯巴特</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化钾</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>牛磺酸</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>肌 酸</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>赫佩斯</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>最终卷</td>
			<td>1 升</td>
		</tr>
<tr>
<td>与 KOH 的最终 pH</td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:修改后的知识库解决方案。可提前、无引用且在-20°C下存储长达 2 个月的修改 KB 溶液配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
			<td>5.55 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1.8 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>股票泰洛德的pH 7.4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>肝 素</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:用葡萄糖、镁、钙和肝素修饰Tyrode的pH7.4溶液。用于心房组织解剖的改良Tyrode的pH 7.4溶液的组成。此溶液应新鲜,并保持在35°C水浴,直到使用。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
			<td>18.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>牛磺酸</td>
			<td>49.96 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>15毫克</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0.066 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>股票泰洛德的pH 6.9</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表4:含有葡萄糖、牛磺酸、BSA和低钙的改良Tyrode的pH 6.9溶液。用于心房肌细胞分离的经过改良的Tyrode pH 6.9溶液的组成。此溶液应新鲜,并保持在35°C水浴,直到使用。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td>胶原 酶</td>
			<td>1,064 U</td>
		</tr>
<tr>
<td>弹性 蛋白酶</td>
			<td>9 U</td>
		</tr>
<tr>
<td>蛋白酶解决方案</td>
			<td>65.2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>修改泰洛德的pH 6.9</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表5:酶溶液。用于酶消化心房组织条的酶溶液的组成。此溶液应新鲜,并保持在35°C水浴,直到使用。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>参数</td>
			<td>平均</td>
		</tr>
<tr>
<td>RMP (mV)</td>
			<td>-74.2 × 0.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>最大 V 值(V/秒)</td>
			<td>144.6 × 5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>操作系统(mV)</td>
			<td>71.9 ± 3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>APD50 (毫秒)</td>
			<td>11.1 × 1.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>APD70 (毫秒)</td>
			<td>23.0 × 4.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>APD90 (毫秒)</td>
			<td>54.7 × 7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>表 6:隔离心房肌细胞的 AP 参数摘要。数据以均值 = SEM、n = 10 个心房肌细胞的形式呈现,从 15 周雄性野生型 C57Bl/6 小鼠中分离出来。 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>钾电流和AP</td>
			<td>钠电流</td>
			<td>钙电流</td>
		</tr>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>在 mM 中</td>
			<td>在 mM 中</td>
			<td>在 mM 中</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>140</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化钾</td>
			<td>5.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>卡Cl2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>赫佩斯</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
			<td>5.5</td>
			<td>5.5</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cscl</td>
			<td></td>
			<td>130</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TEA-Cl</td>
			<td></td>
			<td>5.4</td>
			<td>145.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.4 与 NaOH</td>
			<td>7.4 与 CsOH</td>
			<td>7.4 与 CsOH</td>
		</tr>
</tbody></table>表7:在贴片夹实验中使用的Tyrode溶液的组成。Tyrode的解决方案的组成用于记录AP,I Na,ICa,L,和IK从孤立的心房肌细胞。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>钾电流和AP</td>
			<td>钠电流</td>
			<td>钙电流</td>
		</tr>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>在 mM 中</td>
			<td>在 mM 中</td>
			<td>在 mM 中</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化钾</td>
			<td>140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>卡Cl2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>赫佩斯</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mg-ATP</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>纳-GTP</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>鼻磷肌酸</td>
			<td>6.6</td>
			<td></td>
			<td>6.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cscl</td>
			<td></td>
			<td>130</td>
			<td>135</td>
		</tr>
<tr>
<td>巴普塔</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.2 与 KOH</td>
			<td>7.2 与 CsOH</td>
			<td>7.2 与 CsOH</td>
		</tr>
</tbody></table>表8:贴片夹实验中使用的内部移液器溶液的组成。用于记录AP、I Na、ICa、L和IK的移液器填充溶液的组成,来自孤立的心房肌细胞。

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Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

该协议用于使用块消化方法从成年小鼠心脏分离单个心房心肌细胞。这种方法用于分离右心房或左心房肌细胞,可用于在贴片夹研究中描述心房肌细胞电生理学。

从成年小鼠分离心膜肌细胞

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

将心房肌细胞隔离用于贴片夹实验，极大地增进了我们在细胞和分子水平上对心房电生理学的了解和理解。我们使用的方法有效地产生大量的孤立的心房肌细胞，可用于研究细胞心房电生理学和心律失常在广泛的实验模型和条件。我们采用了一种主干消化方法来隔离心房菌体。这种方法的优点是，它允许研究人员选择他们想要调查的特定区域。从准备文本协议中描述的设备和解决方案开始此过程。布置解剖板、解剖工具、巴斯德移液器和防火抛光移液器。该协议可对雄性或雌性野生小鼠、携带基因突变的小鼠和小鼠疾病模型执行。按照文本协议中描述的鼠标安乐死，将鼠标放在纸巾或软木板上，用胶带将爪子固定到位。用70%乙醇弄湿老鼠的胸部。用弯曲的剪刀去除覆盖胸部的毛皮和皮肤。接下来使用大鼠牙钳提起胸骨，然后沿着肋骨边缘切割隔膜。用弯曲的剪刀切除整个肋骨，露出心脏。要去除心房附属物，请用精细的解剖钳轻轻提起附属物，用弹簧剪刀将其切开。立即将心房附属物转移到硅涂层解剖盘中，其中含有 20 毫升加热改性 Tyrode 的 pH 7.4 溶液。将一个解剖销放在顶部，一个销放在心房附属物开口的底部。使用巴斯德移液器，用加热的经过的泰洛德 pH 7.4 溶液冲洗 atria 以去除血液。沿其顶部和底部边缘切割打开心房附属物。接下来，将心房附属物的角固定下来，形成一个扁平的矩形组织。使用弹簧剪刀和细钳将心房附属物切成大约 8 到 10 个大小相等的条。请注意，条带一旦从主组织上切割，就收缩。使用小孔防火抛光移液器，将组织条转移到第一管中，其中含有加热的改性 Tyrode 的 pH 6.9 溶液。等五分钟现在，使用中孔防火抛光移液器将组织条转移到含有修改的 Tyrode pH 6.9 溶液的第二轮底部管中。要清洗组织条，盖上五毫升圆底管，轻轻反转管三次。让组织条沉淀到管的底部，然后使用中孔防火抛光移液器将组织条转移到第三管。通过反转再次清洗条带。然后，使用中孔防火抛光移液器将组织条转移到酶溶液中，并孵育30分钟。每三到五分钟旋转一次管子，以防止组织条粘附在一起。在酶消化的开始，组织条在旋转后迅速沉淀。在大约20分钟的消化中，组织条在旋转后开始漂浮在酶溶液中。在此期间，心房组织条在消化时也从淡粉色变成白色。酶消化后，在准备好的五毫升圆形底部管中使用2.5毫升KB溶液进行三次洗涤。对于每次洗涤，轻轻反转管三次，然后使用中孔防火抛光移液器将组织移动到下一管。最后洗涤后，将条板转移到含有 2.5 毫升 KB 溶液的 14 毫升圆形底部管中。等五分钟使用宽孔防火抛光移液器轻轻三角组织 7.5 分钟。这将机械地分离组织条，并产生一个浑浊溶液，充满了个别心房菌。第一个三角化必须进行定制，以产生大量的细胞，而不会损害细胞。考虑诸如小鼠的年龄和疾病状况等因素。通过改变从宽孔火抛光移液器中排出组织条的频率和速度，将三化力定制到单个隔离。温和的三角化导致细胞产量低，而严酷的三角化会产生许多死细胞。将含有三化组织条的 14 毫升圆形底部管填充为 7 到 10 毫升的最终体积，具体取决于实验用途所需的细胞密度。将此管在室温下放置一小时。在此潜伏期之后，细胞可用于各种实验长达7小时。这里展示的有来自正常小鼠的分离心房菌的例子。分离的心房菌体通常按100微米的长度和10微米的宽度和清晰的条纹。分离的心房菌的电容通常是40至70皮科法拉。显示了在当前夹紧模式下使用穿孔贴片夹技术记录的心房菌细胞作用电位的例子。在贴片夹技术的整个细胞配置中记录了钠电流的代表性系列。这些电流是在负 100 和正 10 毫伏之间使用 50 毫秒电压夹步记录的，这些电流的保持电位为负 120 毫伏。此处概述了钠电流电压关系。使用负 60 和正 80 毫伏之间的 250 毫秒电压夹步记录了具有代表性的钙电流系列，其保持电位为负 70 毫伏。此处显示了钙电流电压关系摘要。使用负 120 毫伏和正 80 毫伏之间的 500 毫秒电压夹步从负 80 毫伏的保持电位中记录了一个具有代表性的钾电流系列。此处显示了总钾电流的汇总电流电压关系。重要的是要记住，成功的心房菌细胞分离取决于适当的酶消化以及三角分离期间细胞的机械分离。一旦分离，心房菌体可用于贴片夹实验，以测量作用潜力形态和离子电流，如钠电流、钙电流和钾电流。研究心房肌细胞电生理学的变化对于确定威胁心律失常的细胞和分子基础以及开发并测试心房心律失常的抗心律失常化合物至关重要。

Research

JoVE Journal

Medicine

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从部分Pancreatectomized患者的人类胰岛的分离

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