Isolering af atrial Myocytes fra voksne mus

Isolering af atrietenokocytter til brug i patch-clamp eksperimenter har i høj grad avanceret vores viden og forståelse atrietlektrologi på både cellulære og molekylære niveauer. Den tilgang, vi bruger effektivt giver et stort antal isolerede atrie myocytter, der kan bruges til at undersøge cellulære atrielektriske elektrofysiologi og arytmigenese i en bred vifte af eksperimentelle modeller og betingelser. Vi har vedtaget en kuffert fordøjelse tilgang til isolering atrie myocytes.

Fordelen ved denne tilgang er, at det giver forskeren mulighed for at vælge den specifikke region, de ønsker at undersøge. Begynd denne procedure med klargøring af udstyr og opløsninger som beskrevet i tekstprotokollen. Læg dissekerepladen, dissekereværktøjer, en Pasteur-pipette og de brandpolerede pipetter.

Denne protokol kan udføres på mandlige eller kvindelige vilde type mus, mus bærer genetiske mutationer, og mus modeller af sygdom. Efter musens dødshjælp som beskrevet i tekstprotokollen skal du placere musen på en køkkenrulle eller en kork bord og tape poterne ned for at holde musen på plads. Våd brystet af musen med 70% ethanol.

Fjern pels og hud, der dækker brystet ved hjælp af buede saks. Næste brug rotte tand kraftæceser til at løfte brystbenet og derefter skære mellemgulvet langs kanten af ribbenene. Fjern hele brystkassen ved hjælp af buet saks til at eksponere hjertet.

For at fjerne atriefødv, forsigtigt løfte vedhæng ved hjælp af fine dissekere kraftfornælser og skære det ud med foråret saks. Overfør straks atrietilhænget til en siliciumbelagt dissekerende skål indeholdende 20 milliliter opvarmet tyrodens pH 7,4 opløsning. Placer en dissekerende pin øverst og en pin i bunden af åbningen af atriefedt.

Ved hjælp af en Pasteur pipette skylles atriaen med den opvarmede modificerede Tyrods pH 7.4-opløsning for at fjerne blodet. Åbn atrial vedhæng ved at skære langs sin øverste og nederste kant. Dernæst pin hjørnerne af atrietilhæng ned for at skabe en flad rektangulært stykke væv.

Skær atriethæng i ca. otte til 10 lige store strimler ved hjælp af fjedersaks og fine scefæcener. Bemærk, at strimlerne kontrakt, når de er skåret fri fra de vigtigste stykke væv. Ved hjælp af den lille borebrandpolerede pipette overføres vævstrimlerne til det første rør, der indeholder opvarmet modificeret Tyrods pH 6.9-opløsning.

Vent fem minutter. Brug nu den medium borede brandpolerede pipette til at overføre vævstrimler til det anden runde bundrør, der indeholder modificeret Tyrods pH 6,9 opløsning. For at vaske vævstrimler, hætten de fem milliliter runde bundrør og forsigtigt vende røret tre gange.

Lad vævsstrimlerne sætte sig til bunden af røret, før vævsstrimler overføres til det tredje rør ved hjælp af den medium boring brandpolerede pipette. Vask strimlerne igen ved inversion. Derefter overføres vævsstrimlerne til enzymopløsningen ved hjælp af en medium boret brandpoleret pipette og inkuberes i 30 minutter.

Hvirvle røret hver tre til fem minutter for at forhindre væv strimler i at holde sig sammen. I begyndelsen af den enzymatiske fordøjelse, væv strimler bosætte sig hurtigt efter hvirvlende. Ved ca. 20 minutters fordøjelse begynder vævstrimlerne at flyde i den enzymatiske opløsning efter hvirvlende.

I løbet af denne tid, atrievæv strimler også ændre i udseende fra lyserød til hvid, som de er fordøjet. Efter enzymatisk fordøjelse udføres tre vaske ved hjælp af 2,5 milliliter KB-opløsning i de forberedte fem milliliter runde bundrør. For hver vask skal røret vendes forsigtigt tre gange, før du flytter vævet til det næste rør ved hjælp af den medium boring brandpolerede pipette.

Efter den endelige vask overføres strimlerne til det 14 milliliter runde bundrør med 2,5 milliliter KB-opløsning. Vent fem minutter. Triturere forsigtigt vævet i 7,5 minutter ved hjælp af den brede boring brand poleret pipette.

Dette vil mekanisk adskille vævsstrimler og give en overskyet opløsning fyldt med individuelle atrietenocytter. Den første af triturationen skal skræddersys til at give et stort antal celler uden skader på cellerne. Overvej faktorer som musenes alder og sygdomstilstand.

Skræddersy triturationskraften til den enkelte isolation ved at ændre både hyppigheden og hastigheden af udvisningen af vævstrimler fra den brede boreildpolerede pipette. Blid trituration resulterer i et lavt celleudbytte, mens hård trituration vil give mange døde celler. Det runde bundrør på 14 milliliter, der indeholder de triturerede vævsstrimler, med KB-opløsning til et endeligt volumen på syv til 10 milliliter afhængigt af den ønskede tæthed af celler til eksperimentel brug.

Anlå dette rør ved stuetemperatur i en time. Efter denne inkubationstid kan celler anvendes til en række forskellige eksperimenter i op til syv timer. Vist her er eksempler på isolerede atrie myocytter fra normale mus.

Isolerede atriemocytter er typisk i rækkefølgen af 100 mikron i længden og 10 mikron i bredden med klare riller. Kapacitans af isolerede atrietenocytter er typisk 40 til 70 picofarads. Et eksempel på en atriet myocyte handling potentiale registreres ved hjælp af perforeret patch-clamp teknik i nuværende klemme tilstand er vist.

En repræsentativ familie af natrium strømme blev registreret i hele celle konfigurationen af patch-clamp teknik. Disse strømme blev registreret ved hjælp af 50 millisekund spænding klemme trin mellem negative 100 og positive 10 millivolts fra en bedrift potentiale på negative 120 millivolts. Et resumé natrium strøm spænding forholdet præsenteres her.

En repræsentativ familie af calcium strømme blev registreret ved hjælp af 250 millisekund spænding klemme trin mellem negative 60 og positive 80 millivolts fra en bedrift potentiale på negative 70 millivolts. En oversigt calcium strømspænding forhold vises her. En repræsentativ familie af kaliumstrømter blev registreret fra en bedriftspotentiale på negative 80 millivolt ved hjælp af 500 millisekundspændingsklemmertrin mellem negative 120 millivolt og positive 80 millivolt.

Her vises det sammenfattende strømspændingsforhold for den samlede kaliumstrøm. Det er vigtigt at huske, at en vellykket atrierial myocyte isolation afhænger af både en passende enzymatisk fordøjelse samt mekanisk dissociation af cellerne under trituration. Når isoleret, atrie-myocytter kan anvendes i patch-clamp eksperimenter til målinger af virkning potentielle morfologi og ioniske strømme, såsom natrium strømme, calcium strømme, og kalium strømme.

Undersøgelse af ændringer i atrietentoktelektrofysiologi har været afgørende for at bestemme det cellulære og molekylære grundlag af livstruende atriearytmier og for udvikling og afprøvning af antiarytmiske forbindelser for atriearytmier.