Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

Het isoleren van de atrium myocyten voor gebruik in patch-clamp experimenten heeft sterk geavanceerde onze kennis en het begrijpen van atrium elektrofysiologie op zowel de cellulaire en moleculaire niveaus. De aanpak die we gebruiken levert effectief grote aantallen geïsoleerde atrium myocyten op die kunnen worden gebruikt om cellulaire atriumelelektrofysiologie en aritmogenese te onderzoeken in een breed scala van experimentele modellen en aandoeningen. We hebben gekozen voor een stam spijsvertering aanpak voor het isoleren van atrium myocyten.

Het voordeel van deze aanpak is dat het de onderzoeker in staat stelt om de specifieke regio te kiezen die ze willen onderzoeken. Begin deze procedure met de voorbereiding van apparatuur en oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Leg de ontleedplaat, ontleed gereedschap, een Pasteur pipet, en de vuur gepolijste pipetten.

Dit protocol kan worden uitgevoerd op mannelijke of vrouwelijke wilde type muizen, muizen die genetische mutaties, en muis modellen van de ziekte. Na muiseuthanasie zoals beschreven in het tekstprotocol, plaats de muis op een papieren handdoek of een kurkenplank en plak de poten vast om de muis op zijn plaats te houden. Maak de borst van de muis nat met 70% ethanol.

Verwijder de vacht en de huid die de borst bedekken met een gebogen schaar. Gebruik vervolgens rattentand tangen om het borstbeen op te heffen en vervolgens het middenrif langs de rand van de ribben te snijden. Verwijder de volledige ribbenkast met behulp van gebogen schaar om het hart bloot te leggen.

Om het atriumaanhangsel te verwijderen, til je het aanhangsel voorzichtig op met fijne ontledende tangen en knip het eruit met een veerschaar. Breng het atriumhange onmiddellijk over op een met silicium bekleed ontleedschotel met 20 milliliter verwarmde gemodificeerde Tyrode's pH 7.4-oplossing. Plaats een ontleden pin aan de bovenkant en een pin aan de onderkant van de opening van het atrium aanhangsel.

Spoel met behulp van een Pasteur pipet de atria door met de verwarmde gemodificeerde Tyrode pH 7.4-oplossing om het bloed te verwijderen. Open het atrium aanhangsel door langs de boven- en onderkant te snijden. Vervolgens pin de hoeken van het atriumaanhangsel naar beneden om een plat rechthoekig stuk weefsel te creëren.

Snijd het atrium aanhangsel in ongeveer acht tot 10 stroken van gelijke grootte met behulp van veerschaar en fijne tangen. Merk op dat de strips contract zodra ze zijn gesneden uit het belangrijkste stuk weefsel. Breng met behulp van de kleine gepoetste pipet de weefselstrips over in de eerste buis met verwarmde gemodificeerde Tyrode's pH 6.9-oplossing.

Wacht vijf minuten. Gebruik nu de medium bore fire gepolijste pipet om de weefselstrips over te brengen naar de tweede ronde buis met bodem met de pH 6.9-oplossing van Tyrode. Om de weefselstrips te wassen, dop u de vijf milliliter ronde buis met de bodem en draai de buis voorzichtig drie keer om.

Laat de weefselstrips naar de bodem van de buis belanden voordat u de weefselstrips naar de derde buis overzet met behulp van de medium bore fire gepolijste pipet. Was de reepjes opnieuw door inversie. Breng vervolgens de weefselstrips in de enzymoplossing met behulp van een medium boring fire gepolijste pipet en incubbate gedurende 30 minuten.

Draai de buis om de drie tot vijf minuten om te voorkomen dat de weefselstrips aan elkaar blijven vasthangen. Aan het begin van de enzymatische spijsvertering, weefsel strips vestigen zich snel na wervelende. Op ongeveer 20 minuten van de spijsvertering, de weefselstrips beginnen te zweven in de enzymatische oplossing na werveling.

Gedurende deze tijd veranderen de verschillende weefselstrips ook in uiterlijk van lichtroze naar wit terwijl ze worden verteerd. Na enzymatische spijsvertering, voer drie wasbeurten met behulp van 2,5 milliliter KB-oplossing in de voorbereide vijf milliliter ronde buizen. Voor elke wasbeurt, voorzichtig omkeren van de buis drie keer voordat u het weefsel naar de volgende buis met behulp van de medium boring vuur gepolijstpipet.

Na de laatste wasbeurt, breng de strips in de 14 milliliter ronde bodem buis met 2,5 milliliter KB oplossing. Wacht vijf minuten. Triturate het weefsel voorzichtig gedurende 7,5 minuten met behulp van de brede boring vuur gepolijste pipet.

Dit zal mechanisch scheiden van de weefselstrips en opbrengst een troebele oplossing gevuld met individuele atrium myocyten. De eerste van de trituratie moet worden aangepast om een groot aantal cellen te leveren zonder schade aan de cellen. Denk aan factoren zoals de leeftijd van de muizen en de ziektevoorwaarde.

Pas de kracht van trituratie aan op de individuele isolatie door zowel de frequentie als de snelheid van het verdrijven van de weefselstrips uit de brede boorbrand gepolijste pipet te veranderen. Zachte trituratie resulteert in een lage celopbrengst, terwijl harde trituratie veel dode cellen zal opleveren. Vul de 14 milliliter ronde buis met bodem met de triturated weefselstrips met KB-oplossing tot een eindvolume van zeven tot 10 milliliter, afhankelijk van de gewenste dichtheid van cellen voor experimenteel gebruik.

Plaats deze buis op kamertemperatuur gedurende een uur. Na deze incubatietijd kunnen cellen maximaal zeven uur worden gebruikt voor verschillende experimenten. Hier worden voorbeelden getoond van geïsoleerde atrium myocyten van normale muizen.

Geïsoleerde atrium myocyten zijn meestal op de orde van 100 micron in lengte en 10 micron in de breedte met duidelijke strepen. De capaciteit van geïsoleerde atrium myocyten is meestal 40 tot 70 picofarads. Een voorbeeld van een atrium myocyten actie potentieel opgenomen met behulp van de geperforeerde patch-clamp techniek in de huidige klem modus wordt getoond.

Een representatieve familie van natriumstromen werd geregistreerd in de gehele celconfiguratie van de patch-clamp techniek. Deze stromen werden geregistreerd met behulp van 50 milliseconde spanningsklem stappen tussen negatieve 100 en positieve 10 millivolt van een bedrijf potentieel van negatieve 120 millivolt. Een samenvatting natriumstroom spanningsrelatie wordt hier gepresenteerd.

Een representatieve familie van calciumstromen werd geregistreerd met behulp van 250 milliseconde spanningsklem stappen tussen negatieve 60 en positieve 80 millivolt van een bedrijf potentieel van negatieve 70 millivolt. Een samenvatting calcium stroom spanning relatie wordt hier weergegeven. Een representatieve familie van kaliumstromen werd geregistreerd van een bedrijf potentieel van negatieve 80 millivolt met behulp van 500 milliseconde spanning klem stappen tussen negatieve 120 millivolt en positieve 80 millivolt.

Hier wordt de samenvatting van de huidige spanningsverhouding getoond voor de totale kaliumstroom. Het is belangrijk om te onthouden dat een succesvolle atrium myocyte isolatie afhankelijk is van zowel een passende enzymatische spijsvertering als mechanische dissociatie van de cellen tijdens de trituratie. Eenmaal geïsoleerd, kunnen atrium myocyten worden gebruikt in patch-klem experimenten voor de metingen van de actie potentiële morfologie en ionische stromingen, zoals natriumstromen, calciumstromen, en kaliumstromen.

Het onderzoeken van veranderingen in de atrium myocyten elektrofysiologie is essentieel geweest voor het bepalen van de cellulaire en moleculaire basis van levensbedreigende atriumritmmies en voor de ontwikkeling en het testen van anti-aritmische verbindingen voor atriumritmestoornissen.