בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

בידוד מיוציטים פרוזדור לשימוש בניסויים מהדק טלאי קידם מאוד את הידע שלנו והבנת אלקטרופיזיולוגיה פרוזדור הן ברמה התאית והן ברמה המולקולרית. הגישה בה אנו משתמשים מניבה ביעילות מספר רב של מיוציטים פרוזדור מבודדים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור אלקטרופיזיולוגיה פרוזדורתית תאית והפרעות קצב במגוון רחב של מודלים ותנאים ניסיוניים. אימצנו גישת עיכול תא מטען לבודד מיוציטים פרוזדור.

היתרון של גישה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקר לבחור את האזור הספציפי שהם רוצים לחקור. התחל הליך זה עם הכנת ציוד ופתרונות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פורסים את לוחית הניתוח, כלי ניתוח, פיפטה פסטר, ואת פיפטים מלוטש אש.

פרוטוקול זה יכול להתבצע על עכברים מסוג בר זכר או נקבה, עכברים הנושאים מוטציות גנטיות, מודלים עכבר של מחלה. בעקבות המתת חסד של העכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט, מניחים את העכבר על מגבת נייר או לוח שעם ומדביקים את הכפות כלפי מטה כדי להחזיק את העכבר במקומו. להרטיב את החזה של העכבר עם 70% אתנול.

הסר את הפרווה והעור המכסים את החזה באמצעות מספריים מעוגלים. לאחר מכן להשתמש מדפים שן עכברוש להרים את עצם החזה ולאחר מכן לחתוך את הסרעפת לאורך קצה הצלעות. הסר את כל בית החזה באמצעות מספריים מעוקלים כדי לחשוף את הלב.

כדי להסיר את התוספת פרוזדורים, בעדינות להרים את התוספת באמצעות מטחות ניתוח עדין לחתוך אותו עם מספריים האביב. מיד להעביר את התוספת פרוזדן לצלחת ניתוח מצופה סיליקון המכיל 20 מיליליטר של תוסף מחומם של טירודה שונה pH 7.4 פתרון. מניחים סיכת ניתוח אחת בחלק העליון וסיכה אחת בתחתית פתח התוספת פרוזדורה.

באמצעות פיפטה פסטר, לשטוף את האטריה עם pH של טירוד מחומם שונה 7.4 פתרון כדי להסיר את הדם. פתח את התוספת פרוזדורה על ידי חיתוך לאורך הקצה העליון והתחתון שלה. לאחר מכן, הצמד את הפינות של התוספת פרוזדור למטה כדי ליצור חתיכה מלבנית שטוחה של רקמה.

חותכים את התוספת פרוזדורים לתוך כ 8 עד 10 רצועות בגודל שווה באמצעות מספריים האביב מטחנים עדין. שים לב כי הרצועות חוזה ברגע שהם נחתכים מן פיסת הרקמה העיקרית. באמצעות פיפטה קטנה נשא אש מלוטש, להעביר את רצועות הרקמה לתוך הצינור הראשון המכיל מחומם שונה של טירוד pH 6.9 פתרון.

חכה חמש דקות. עכשיו, להשתמש בינוני נשא פיפטה מלוטש אש להעביר את רצועות הרקמה לצינור התחתון בסיבוב השני המכיל פתרון pH 6.9 של טירוד שונה. כדי לשטוף את רצועות הרקמות, מכסים את הצינור העגול באורך 5 מיליליטר והפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים.

תן רצועות הרקמה להתיישב לתחתית הצינור לפני העברת רצועות הרקמה לצינור השלישי באמצעות המדיום נשא פיפטה מלוטש אש. לשטוף את הרצועות שוב על ידי היפוך. לאחר מכן, להעביר את רצועות הרקמה לתוך פתרון האנזים באמצעות מדיום נשא פיפטה מלוטש אש דגירה במשך 30 דקות.

מערבלים את הצינור כל שלוש עד חמש דקות כדי למנוע מרצועות הרקמה לבקוע יחד. בתחילת העיכול האנזימטי, רצועות רקמות להתיישב במהירות בעקבות מערבולת. בערך 20 דקות של עיכול, רצועות הרקמה מתחילות לצוף בתסיסה האנזימטית לאחר מערבולת.

במהלך תקופה זו, רצועות רקמת פרוזדור גם לשנות את המראה ורוד חיוור לבן כפי שהם מתעכלים. לאחר עיכול אנזימטי, לבצע שלוש שטיפות באמצעות 2.5 מיליליטר של פתרון KB בצינורות מוכנים חמישה מיליליטר עגול התחתון. עבור כל לשטוף, בעדינות להפוך את הצינור שלוש פעמים לפני העברת הרקמה לצינור הבא באמצעות המדיום נשא פיפטה מלוטש אש.

לאחר הכביסה הסופית, להעביר את הרצועות לתוך צינור 14 מיליליטר עגול תחתון המכיל 2.5 מיליליטר של פתרון KB. חכה חמש דקות. בעדינות triturate את הרקמה במשך 7.5 דקות באמצעות פיפטה מלוטש אש רחבה.

זה יהיה מכני ניתוק רצועות הרקמה ותניב פתרון מעונן מלא מיוציטים פרוזדוריים בודדים. הראשון של הטריטורציה חייב להיות מותאם להניב מספר גדול של תאים ללא נזק לתאים. שקול גורמים כגון גיל העכברים ומצב המחלה.

התאימו את כוח הטריטורציה לבידוד הפרט על ידי שינוי התדירות והמהירות של גירוש רצועות הרקמה מהפיגט המלוטש באש. טריטורציה עדינה גורמת לתפוקת תאים נמוכה, בעוד שטריטורציה קשה תניב תאים מתים רבים. מלא את הצינור עם תחתית עגולה של 14 מיליליטר המכיל את פסי הרקמה המשולשים עם פתרון KB לנפח סופי של שבעה עד 10 מיליליטר בהתאם לצפיפות הרצויה של תאים לשימוש ניסיוני.

מניחים את הצינור בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר תקופת הדגירה הזו, ניתן להשתמש בתאים למגוון ניסויים עד שבע שעות. להלן דוגמאות של מיוציטים פרוזדונים מבודדים מעכברים רגילים.

מיוציטים פרוזדורים מבודדים הם בדרך כלל בסדר של 100 מיקרון אורך ו 10 מיקרון ברוחב עם פסי ברור. קיבוליותם של מיוציטים פרוזדורים מבודדים היא בדרך כלל 40 עד 70 פיקופרדים. מוצגת דוגמה לפוטנציאל פעולה של מיוציט פרוזדריאלי שנרשם בטכניקת מלחצי התיקון המנוררים במצב מהדק נוכחי.

משפחה מייצגת של זרמי נתרן נרשמה בכל תצורת התא של טכניקת מהדק הטלאי. זרמים אלה נרשמו באמצעות 50 אלפיות שנייה של צעדי מתח בין שלילי 100 ו חיובי 10 מילי-וולט מפוטנציאל החזקה של שלילי 120 מילי-וולט. מערכת יחסים סיכום מתח זרם נתרן מוצג כאן.

משפחה מייצגת של זרמי סידן נרשמה באמצעות 250 אלפיות שנייה של מהדק מתח צעדים בין שלילי 60 וחיובי 80 מיליבולטים מפוטנציאל החזקה של שלילי 70 מילי-וולט. כאן מוצג קשר מתח זרם סידן מסכם. משפחה מייצגת של זרמי אשלגן נרשמה מפוטנציאל החזקה של 80 מילי-וולט שליליים באמצעות 500 אלפיות שנייה של מהדק מתח בין 120 מילי-וולט שליליים ל-80 מילי-וולטים חיוביים.

כאן מוצג קשר המתח הנוכחי המסכם עבור זרם אשלגן כולל. חשוב לזכור כי בידוד מיוציט פרוזדורי מוצלח תלוי הן בעיכול אנזימטי מתאים והן בדיסוציאציה מכנית של התאים במהלך הטריטורציה. לאחר המבודד, מיוציטים פרוזדוריים יכולים לשמש בניסויים מהדק תיקון למדידות של מורפולוגיה פוטנציאלית פעולה זרמים יוניים, כגון זרמי נתרן, זרמי סידן, זרמי אשלגן.

חקירת שינויים באלקטרופיזיולוגיה של מיוציטים פרוזדור הייתה חיונית לקביעת הבסיס התאי והמולקולרי של הפרעות קצב פרוזדור מסכנות חיים ולהתפתחות ובדיקה של תרכובות אנטי-הפרעות קצב להפרעות קצב פרוזדור.