Isolering av atrieflimmer myocytter fra voksen mus

Isolere atrie myocytter for bruk i patch-clamp eksperimenter har sterkt avansert vår kunnskap og forståelse atrieelektrofysiologi på både cellulære og molekylære nivåer. Tilnærmingen vi bruker gir effektivt et stort antall isolerte atrie myocytter som kan brukes til å undersøke cellulær atrieelektrofysiologi og arytmogenese i et bredt spekter av eksperimentelle modeller og forhold. Vi har vedtatt en trunk fordøyelse tilnærming for å isolere atrie myocytter.

Fordelen med denne tilnærmingen er at den gjør det mulig for forskeren å velge den spesifikke regionen de ønsker å undersøke. Begynn denne prosedyren med utarbeidelse av utstyr og løsninger som beskrevet i tekstprotokollen. Legg ut disseksjonsplaten, dissekeringsverktøyene, en Pasteurpipette og de brannpolerte pipettene.

Denne protokollen kan utføres på mannlige eller kvinnelige villtypemus, mus som bærer genetiske mutasjoner og musemodeller av sykdom. Etter mus eutanasi som beskrevet i tekstprotokollen, plasser musen på et papirhåndkle eller et korkbord og tape potene ned for å holde musen på plass. Våt brystet av musen med 70% etanol.

Fjern pelsen og huden som dekker brystet ved hjelp av buet saks. Bruk deretter rottetanntrang for å løfte brystbenet og deretter kutte membranen langs kanten av ribbeina. Fjern hele brystkassen ved hjelp av buet saks for å eksponere hjertet.

For å fjerne atrievedheng, løft forsiktig vedlegget ved hjelp av fine dissekerings tang og kutt den ut med vårsaks. Overfør umiddelbart atrievedhenget til en silisiumbelagt disseksjonsfat som inneholder 20 milliliter varmet modifisert Tyrodes pH 7.4-løsning. Plasser en dissekeringspinne øverst og en pin nederst på åpningen av atrievedhenget.

Bruk en Pasteur pipette til å skylle atriaen med den varme modifiserte Tyrodes pH 7.4-løsning for å fjerne blodet. Åpne atrievedheng ved å kutte langs den øvre og nedre kanten. Deretter fester du hjørnene av atrievedhenget ned for å skape et flatt rektangulært stykke vev.

Skjær atrievedhenget i omtrent åtte til 10 like store strimler ved hjelp av vårsaks og fine tang. Merk at stripene kontrakt når de er kuttet fri fra hoveddelen av vev. Bruk den lille bore brannpolerte pipetten til å overføre vevstrimlene til det første røret som inneholder oppvarmet modifisert Tyrodes pH 6.9-løsning.

Vent i fem minutter. Bruk nå den mellomborede brannpolerte pipetten til å overføre vevstrimlene til det andre runde bunnrøret som inneholder modifisert Tyrodes pH 6.9-løsning. For å vaske vevstrimlene, het de fem milliliter runde bunnrøret og forsiktig inverter røret tre ganger.

La vevstrimlene bosette seg til bunnen av røret før du overfører vevstrimlene til det tredje røret ved hjelp av den middels bore brannpolerte pipetten. Vask stripene igjen ved inversjon. Deretter overfører vevstrimler inn i enzymløsningen ved hjelp av en middels borende brannpolert pipette og inkubere i 30 minutter.

Virvle røret hvert tredje til femte minutt for å hindre at vevstrimlene kommer sammen. I begynnelsen av den enzymatiske fordøyelsen bosetter vevstrimler seg raskt etter virvlende. Ved ca. 20 minutter med fordøyelse begynner vevstrimlene å flyte i den enzymatiske løsningen etter virvlende.

I løpet av denne tiden endres atrievevstrimlene også i utseende fra blek rosa til hvit når de fordøyes. Etter enzymatisk fordøyelse, utfør tre vasker ved hjelp av 2,5 milliliter KB-løsning i de tilberedte fem milliliter runde bunnrørene. For hver vask, forsiktig inverter røret tre ganger før du flytter vevet til neste rør ved hjelp av den middels bore brannpolerte pipetten.

Etter den siste vasken, overfør stripene til det 14 milliliter runde bunnrøret som inneholder 2,5 milliliter KB-løsning. Vent i fem minutter. Triturat vevet forsiktig i 7,5 minutter ved hjelp av den brede bore brannpolerte pipetten.

Dette vil mekanisk dissosiere vevstrimler og gi en overskyet løsning fylt med individuelle atrie myocytter. Den første av triturasjonen må skreddersys for å gi et stort antall celler uten skade på cellene. Vurder faktorer som musenes alder og sykdomstilstand.

Skreddersy kraften av triturasjon til den enkelte isolasjon ved å endre både hyppigheten og hastigheten på å utvise vevstrimler fra den brede bore brannpolert pipette. Mild triturasjon resulterer i et lavt celleutbytte, mens hard triturasjon vil gi mange døde celler. Fyll 14 milliliter rundt bunnrøret som inneholder triturated vevstrimler med KB-løsning til et endelig volum på syv til 10 milliliter avhengig av ønsket tetthet av celler for eksperimentell bruk.

Plasser dette røret ved romtemperatur i en time. Etter denne inkubasjonsperioden kan celler brukes til en rekke eksperimenter i opptil syv timer. Vist her er eksempler på isolerte atrie myocytter fra normale mus.

Isolerte atrie myocytter er vanligvis i rekkefølge av 100 mikron i lengde og 10 mikron i bredde med klare striations. Kapasitansen av isolerte atrie myocytter er vanligvis 40 til 70 picofarads. Et eksempel på en atrie myocyte handling potensial registrert ved hjelp av perforert patch-klemme teknikk i gjeldende klemme modus vises.

En representativ familie av natriumstrømmene ble registrert i hele cellekonfigurasjonen av patch-clamp-teknikken. Disse strømmene ble registrert ved hjelp av 50 millisekund spenning klemme trinn mellom negative 100 og positive 10 millivolt fra et holdingpotensial på negative 120 millivolts. Her presenteres det et sammendrag av natriumstrømspenningsforholdet.

En representativ familie av kalsiumstrøm ble registrert ved hjelp av 250 millisekund spenning klemme trinn mellom negative 60 og positive 80 millivolt fra et holdingpotensial på negative 70 millivolts. Et sammendrag av kalsiumstrømspenningsforhold vises her. En representativ familie av kalium strømmer ble registrert fra en holding potensial av negative 80 millivolts ved hjelp av 500 millisekunder spenning klemme skritt mellom negative 120 millivolts og positive 80 millivolts.

Her er sammendraget gjeldende spenningsforhold vist for total kaliumstrøm. Det er viktig å huske at en vellykket atrie myocyttisolasjon avhenger av både en passende enzymatisk fordøyelse samt mekanisk dissosiasjon av cellene under triturasjon. Når isolert, atrie myocytter kan brukes i patch-klemme eksperimenter for målinger av handling potensielle morfologi og ioniske strømmer, som natrium strømmer, kalsium strømmer, og kalium strømmer.

Å undersøke endringer i atrie myocyttelektrofysiologi har vært avgjørende for å bestemme det cellulære og molekylære grunnlaget for livstruende atriearytmier og for utvikling og testing av antiarytmiske forbindelser for atriearytmier.