Isolering av Förmaksmyocyter från vuxna möss

Isolera de förmaksmyocyter för användning i patch-clamp experiment har kraftigt avancerade vår kunskap och förståelse förmaksa electrofysiologi på både cellulära och molekylära nivåer. Det tillvägagångssätt vi använder effektivt ger ett stort antal isolerade förmaksmyocyter som kan användas för att undersöka cellulär förmakselektrofysiologi och arrytmogenesis i ett brett spektrum av experimentella modeller och tillstånd. Vi har antagit en stam matsmältningen strategi för att isolera förmaksar myocyter.

Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det gör det möjligt för forskaren att välja den specifika region de vill undersöka. Påbörja denna procedur med beredning av utrustning och lösningar enligt beskrivningen i textprotokollet. Lägg ut dissekeringsplattan, dissekera verktyg, en Pasteurpipett och de brandpolerade pipetterna.

Detta protokoll kan utföras på manliga eller kvinnliga vilda typ möss, möss som bär genetiska mutationer, och mus modeller av sjukdom. Efter mus dödshjälp som beskrivs i textprotokollet, placera musen på en pappershandduk eller en kork ombord och tejpa tassarna ner för att hålla musen på plats. Blöt bröstet av musen med 70%etanol.

Ta bort pälsen och huden som täcker bröstet med hjälp av böjd sax. Nästa användning råtta tand forceps för att lyfta bröstbenet och sedan klippa membranet längs kanten av revbenen. Ta bort hela bröstkorgen med hjälp av böjd sax för att exponera hjärtat.

För att ta bort förmaksbihanget lyfter du försiktigt bihanget med hjälp av fina dissekeringsstärknämpar och skär ut det med vårsax. Överför omedelbart förmaksbihanget till en silikonbelagd dissekeringsfat innehållande 20 milliliter av värmd modifierad Tyrodes pH 7.4-lösning. Placera en dissekering stift upptill och en stift längst ner i öppningen av förmaksbihang.

Spola med hjälp av en Pasteurpipett med den uppvärmda modifierade Tyrodeens pH 7.4-lösning för att avlägsna blodet. Öppna förmaksbihanget genom att skära längs dess överkant och nederkant. Därefter stift hörnen av förmaksbilasage ner för att skapa en platt rektangulär bit vävnad.

Skär förmaksbihang i cirka åtta till 10 lika stora remsor med hjälp av vårsax och fina tlyktor. Observera att remsorna kontrakt när de skärs fria från de viktigaste bit av vävnad. Med hjälp av den lilla bar brandpolerade pipetten, överför vävnadsremsorna till det första röret som innehåller värmd modifierad Tyrode s pH 6.9-lösning.

Vänta fem minuter. Nu, använd medium bar brand polerad pipetten för att överföra vävnadsremsor till den andra omgången bottnat rör som innehåller modifierade Tyrode s pH 6.9 lösning. För att tvätta vävnadsremsorna, locket de fem milliliter runda bottnat röret och försiktigt invertera röret tre gånger.

Låt vävnadsremsorna lägga sig till botten av röret innan du överför vävnadsremsorna till det tredje röret med hjälp av medelbortbrandspolerad pipetten. Tvätta remsorna igen genom inversion. Överför sedan vävnadsremsorna till enzymlösningen med hjälp av en medelborrstspolerad pipett och inkubera i 30 minuter.

Snurra röret var tredje till femte minut för att förhindra att vävnadsremsorna ansluter sig tillsammans. I början av den enzymatiska matsmältningen, vävnad remsor bosätta sig snabbt efter virvlande. Vid cirka 20 minuters matsmältning börjar vävnadsremsorna att flyta i den enzymatiska lösningen efter virvlande.

Under denna tid ändras även förmaksbanden i utseende från ljusrosa till vita när de smälts. Efter enzymatisk matsmältning, utföra tre tvättar med 2,5 milliliter KB lösning i den beredda fem milliliter runda bottnat rör. För varje tvätt, försiktigt invertera röret tre gånger innan du flyttar vävnaden till nästa rör med hjälp av medium bar brand polerad pipetten.

Efter den slutliga tvätten, överför remsorna till 14 milliliter runda bottnat rör som innehåller 2,5 milliliter KB-lösning. Vänta fem minuter. Triturtera försiktigt vävnaden i 7,5 minuter med hjälp av den breda bareldspolerade pipetten.

Detta kommer mekaniskt att dissociate vävnadsremsorna och ge en grumlig lösning fylld med enskilda förmaksflacyter. Den första av triturationen måste skräddarsys för att ge ett stort antal celler utan skador på cellerna. Beakta faktorer som mössens ålder och sjukdomstillstånd.

Skräddarsy kraften av trituration till den individuella isoleringen genom att ändra både frekvens och hastighet av utvisa vävnadsremsorna från den breda bar brandpolerad pipett. Mild trituration resulterar i en låg cell avkastning, medan hårda trituration kommer att ge många döda celler. Fyll det runda bottenbottna röret med 14 milliliter som innehåller de triturerade vävnadsremsorna med KB-lösning till en slutvolym på sju till tio milliliter beroende på önskad densitet av celler för experimentell användning.

Placera detta rör i rumstemperatur i en timme. Efter denna inkubationstid kan celler användas för en mängd olika experiment i upp till sju timmar. Visas här är exempel på isolerade förmaks myocyter från normala möss.

Isolerade förmaks myocyter är typiskt på storleksordningen 100 mikrometer i längd och 10 mikrometer i bredd med tydliga striations. Kapacitansen av isolerade förmaks myocyter är typiskt 40 till 70 picofarads. Ett exempel på en förmaks myocyte action potential registreras med hjälp av perforerade patch-clamp teknik i nuvarande klämma läge visas.

En representativ familj av natrium strömmar spelades in i hela cellen konfiguration av patch-clamp tekniken. Dessa strömmar registrerades med hjälp av 50 millisekunders spänningsklämmor steg mellan negativa 100 och positiva 10 millivolt från en anläggningspotential på negativa 120 millivolt. En sammanfattning natriumström spänningsförhållande presenteras här.

En representativ familj av kalciumströmmar registrerades med hjälp av 250 millisekkunder spänning klämma steg mellan negativa 60 och positiva 80 millivolt från en anläggning potential negativa 70 millivolt. En sammanfattande kalciumströmspänningsrelation visas här. En representativ familj av kaliumströmmar registrerades från en anläggningspotential på negativa 80 millivolt med 500 millisekkunder spänningsklämsteg mellan negativa 120 millivolt och positiva 80 millivolt.

Här visas den summariska strömspänningsrelationen för total kaliumström. det är viktigt att komma ihåg att en framgångsrik förmaks- myocyte isolering beror på både en lämplig enzymatisk matsmältning samt mekanisk dissociation av cellerna under trituration. När isolerade, förmaks myocyter kan användas i patch-clamp experiment för mätningar av åtgärder potentiella morfologi och joniska strömmar, såsom natrium strömmar, kalcium strömmar, och kaliumströmmar.

Undersöka förändringar i förmaksvis myocyte elektrofysiologi har varit avgörande för att fastställa cellulära och molekylära grunden för livshotande förmaksarrytmier och för utveckling och testning av anti-arytmiska föreningar för förmaksarrytmier.