Name: studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection at JoVE.com

Siamo grati a Deborah A. Schaefer della School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, Università dell'Arizona, Tucson, Az, USA per averci aiutato con la produzione e l'analisi degli oocisti. Ringraziamo anche Franceschi Microscopy and Imaging Center e D.L. Mullendore alla Washington State University per la preparazione e l'imaging di oocisti organoidi isolati.
D.D. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 863.14.002) ed è stata sostenuta dalle borse Marie Curie della Commissione europea (Proposta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del ERC Advanced Grant Agreement n. 67013 e da NIH NIAIH sotto R21 AT009174 a RMO. Questo lavoro fa parte dell'Oncode Institute, che è in parte finanziato dalla Società Olandese per il Cancro ed è stato finanziato da una sovvenzione della Società Olandese per il Cancro.

Tutta la manipolazione e la resezione dei tessuti è stata eseguita in base ai protocolli approvati dall'IRB (Institutional Review Board) con il consenso del paziente.
1. Preparazione di C. parvum Oocysts per l'iniezione
 NOT:</</c0> Cryptosporidium oocisti sono stati acquistati da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei Materiali). Queste oocisti sono prodotte in vitelli e sono conservate in salina tampone di fosfato (PBS...

<ol>
	<li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+global+burden,+novel+diagnostics,+therapeutics,+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium.">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li><li>Bones, A. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology.">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions.">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems.">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection.">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li><li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+infections:+molecular+advances.">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li><li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells.">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li><li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cpgp40/15+in+Toxoplasma+gondii:+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens.">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li><li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro.">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li><li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum.">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li><li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids.">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li></ol>

La coltura dei parassiti del Cryptosporidium negli organoidi intestinali e delle vie aeree fornisce un modello accurato per studiare le interazioni ospite-parassita10, ma ha anche molte altre applicazioni. Ad esempio, gli attuali metodi di selezione e propagazione dei parassiti del Cryptosporidium geneticamente modificati richiedono un passaggio nei topi19, il che non consente l'isolamento dei parassiti che hanno modifiche essenziali per l'infezione in viv...

Lo sviluppo di farmaci o vaccini per il trattamento e la prevenzione dell'infezione da Cryptosporidium è stato ostacolato dalla mancanza di sistemi in vitro che imitano precisamente la situazione in vivonell'uomo 1,2. Molti dei sistemi attualmente disponibili consentono solo l'infezione a breve termine (<5 giorni) o non supportano l'intero ciclo di vita del parassita3,4. Altri sistemi che consentono il completo sviluppo del parassita si basano su linee cellulari immortalate o linee cellulari tumorali che non ricapitolano fedelmente la situazione fisiologicanell'uomo 5,6,7 . Gli organoidi o "mini-organi" sono strutture derivate di tessuto 3D che vengono coltivate in una matrice extracellulare integrata con vari fattori di crescita specifici del tessuto. Gli organiidi sono stati sviluppati da vari organi e tessuti. Sono geneticamente stabili e riassumono la maggior parte delle funzioni degli organi della loro origine, e possono essere mantenuti in coltura per lunghi periodi di tempo. Abbiamo sviluppato un metodo per infettare gli organoidi intestinali e polmonari umani con il Cryptosporidium che fornisce un modello accurato in vitro per lo studio delle interazioni ospite-parassita rilevanti per la criptosporidiosi intestinale e respiratoria8 ,9,10,11,12,13. A differenza di altri modelli di coltura pubblicati, il sistema organoide è rappresentativo delle interazioni reali dell'ospite, consente il completamento del ciclo di vita in modo che tutte le fasi del ciclo di vita dei parassiti possano essere studiate e mantenga la propagazione dei parassiti per un massimo di 28 giornie 10.
Cryptosporidium parvum è un parassita apicomplexa che infetta l'epitelio dei tratti respiratori e intestinali, causando una malattia di diarrea prolungata. Lo stadio ambientale resistente è l'oocisti, che si trova negli alimenti e nell'acqua contaminati14. Una volta ingerito o inalato, l'oocisti si estingo e rilascia quattro sporozoiti che si attaccano alle cellule epiteliali. Gli sporozoiti scivolano sulle cellule ospiti e coinvolgono i recettori delle cellule ospiti, ma il parassita non invadere completamente la cellula e sembra indurre la cellula ospite a inghiottirla15. Il parassita, che viene interiorizzato all'interno di un compartimento intracellulare ma extracitoplasmatica, rimane sulla superficie apicale della cellula, replicandosi all'interno di un vacuolo parassofoso. Subisce due cicli di riproduzione asessuata, un processo chiamato merogonia. Durante la meroginia, si sviluppano meronts di tipo I che contengono otto merozoiti che vengono rilasciati per invadere nuove cellule. Questi merozoiti invadono nuove cellule per svilupparsi in meront di tipo II contenenti quattro merozoiti. Questi merozoiti, una volta rilasciati, infettano le cellule e si sviluppano in macrogamont e microgamont. I microgameti vengono rilasciati e fertilizzano i macrogameti che producono zigoti che maturano in oocisti. Le oocisti mature vengono successivamente rilasciate nel lume. Le oocisti sono o a parete sottile che immediatamente si estesciper reinfettare per reinfettare l'epitelio, o spesse mura che vengono rilasciate nell'ambiente per infettare il prossimo ospite14. Tutte le fasi del ciclo di vita di Cryptosporidium sono state identificate nel sistema di coltura organoide precedentemente sviluppato dal nostro gruppo10.
Dal momento che gli organoidi umani replicano fedelmente i tessuti umani9,11,13, e supportano tutte le fasi replicative del Cryptosporidium10, sono il sistema di coltura dei tessuti ideale per studiare Biologia del cryptosporidium e interazioni ospite-parassita. Qui descriviamo le procedure per infettare gli organoidi sia con le oocisti di Cryptosporidium che con gli sporozoiti eccitati e per isolare le nuove oocisti prodotte in questo sistema di coltura tissutale.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Basement membrane extract (extracellular matrix)</td>
<td>amsbio</td>
<td>3533-010-02</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLR-1X</td>
<td>Final Concentration = Use 2-3 drops/slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 15 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12301D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dynamag 2 rack</td>
<td>Thermofisher Scientific</td>
<td>12321D</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>EMD Millipore&nbsp;Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3&micro;m</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast green dye</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F7252-5G&nbsp;&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Femtojet 4i Microinjector</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5252000013</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass capillaries of 1 mm diameter</td>
<td>WPI</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrigel (extracellular matrix)</td>
<td>Corning</td>
<td>356237</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Microfuge tube 1.5ml</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>T9661-1000EA</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-loader tips</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>612-7933</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller P-97</td>
<td>Shutter instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Normal donkey Serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium hypoclorite (use 5%)</td>
<td>Clorox</td>
<td>50371478</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Super stick slides</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>S100-3</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder</td>
<td>EMD-Millipore</td>
<td>SX0002500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurocholic acid sodium salt hydrate</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4009-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>Merck</td>
<td>8221840500</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield mounting agent</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Vortex Genie 2</td>
<td>Scientific industries, Inc</td>
<td>SI0236</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final amount</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12634-010</td>
<td>500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Penstrep</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamax</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050038</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630056</td>
<td>5ml of stock in 500ml DMEM</td>
</tr>
<tr>
<td> INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>0.5&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Peprotech</td>
<td>AF-100-15</td>
<td>50ng/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
<td>Tocris</td>
<td>3006-1mg</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>NAC</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>NIC</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>P38 inhibitor (SB202190)</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>10&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>PGE2</td>
<td>Tocris</td>
<td>2296/10</td>
<td>10 nM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1ml/500ml media</td>
</tr>
<tr>
<td>RSpoI CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20%</td>
</tr>
<tr>
<td>Wnt3a CM</td>
<td>In house*</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>In house* - cell lines will be provided upon request</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)</td>
</tr>
<tr>
<td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Adv+++</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>make upto 100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>ALK-I A83-01</td>
<td>Tocris</td>
<td>2939-50mg</td>
<td>500nM</td>
</tr>
<tr>
<td>B27</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>0.0763888889</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-10</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-26</td>
<td>100ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FGF-7</td>
<td>Peprotech</td>
<td>100-19</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9125-25G</td>
<td>1.25mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
<td>Sigma</td>
<td>N0636-100G</td>
<td>5mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Noggin UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>p38 MAPK-I</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7076-25 mg</td>
<td>1&micro;M</td>
</tr>
<tr>
<td>Primocin</td>
<td>InvivoGen</td>
<td>ant-pm-1</td>
<td>1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>RhoKI Y-27632</td>
<td>Abmole Bioscience</td>
<td>M1817_100 mg</td>
<td>2.5&micro;m</td>
</tr>
<tr>
<td>Rspo UPE</td>
<td>U-Protein Express</td>
<td>Contact company directly</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutathione reduced</td>
<td>Sigma</td>
<td>G4251-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Betaine</td>
<td>Sigma</td>
<td>61962</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>Sigma</td>
<td>168149-2.5G</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Linoleic acid</td>
<td>Sigma</td>
<td>L1376-10MG</td>
<td>6.8 &mu;g/ml of OME/OMD /LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Taurine</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0625-10MG</td>
<td>0.5 &mu;g/&mu;l of OME/OMD/LOM</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking buffer (for immunoflourescence staining)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey/Goat serum</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>C06SB</td>
<td>2%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>70011044</td>
<td>Make upto 100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Merck</td>
<td>P1379</td>
<td>0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>List of Antibodies used </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-11011</td>
<td>Dilution-1:500; RRID: AB_143157</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A400FLK</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>IMS400-20</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-Alexa 674</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22287</td>
<td>Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O'Connor (co-author).</td>
<td>Upon request</td>
<td>Upon request</td>
<td>Dilution-1:500</td>
</tr>
<tr>
<td>Sporo-Glo</td>
<td>Waterborne, Inc</td>
<td>A600FLR-1X</td>
<td>Dilution- 1:200</td>
</tr>
</tbody>
</table>

studying cryptosporidium infection in 3d tissue-derived human organoid culture systems by microinjection

Cryptosporidium parvum è una delle principali cause della malattia della diarrea umana. Per comprendere la patologia del parassita e sviluppare farmaci efficienti, è necessario un sistema di coltura in vitro che riassume le condizioni nell'ospite. Gli organiidi, che assomigliano molto ai tessuti della loro origine, sono ideali per studiare le interazioni ospite-parassita. Gli organiidi sono strutture derivate da tessuti tridimensionali (3D) che derivano da cellule staminali adulte e crescono in coltura per lunghi periodi di tempo senza subire alcuna aberrazione genetica o trasformazione. Hanno una polarità ben definita con superfici apicali e basolaterali. Gli organiidi hanno varie applicazioni nei test farmacologici, nel bio banking e nella modellazione della malattia e negli studi sull'interazione tra host e microbo. Qui presentiamo un protocollo passo-passo di come preparare le oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium per infettare gli organoidi intestinali e delle vie aeree umane. Dimostriamo quindi come la microiniezione può essere utilizzata per iniettare i microbi nel lume organoide. Ci sono tre metodi principali con cui gli organoidi possono essere utilizzati per gli studi di interazione host-microbe: microiniezione, tosatura meccanica e placcatura, e facendo monostrati. La microiniezione consente il mantenimento della struttura 3D e consente un controllo preciso dei volumi di parassiti e il contatto laterale apicale diretto per i microbi. Forniamo dettagli per una crescita ottimale degli organoidi per la produzione di imaging o oocisti. Infine, dimostriamo anche come le oocisti appena generate possono essere isolate dall'organoid per un'ulteriore elaborazione e analisi a valle.

I protocolli qui presentati si traducono in un'efficiente purificazione di oocisti e sporozoiti (Figura 1A) pronti per la microiniezione. Il protocollo di esostation si traduce nel rilascio di sporozoiti da circa il 70-80% delle oocisti, quindi è essenziale filtrare le rimanenti oocisti e gusci attraverso un filtro da 3 m. Filtrazione risultati in quasi 100% sporozoite purificazione (Figura 1B). Inoltre, l'aggiunta di un coloranti verde aiuta a garantire l'inie...

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Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Descriviamo protocolli per preparare le oocisti e purificare gli sporozoiti per studiare l'infezione degli organoidi intestinali e delle vie aeree da Cryptosporidium parvum. Dimostriamo le procedure per la microiniezione di parassiti nel lume organoide intestinale e l'immunostaining degli organoidi. Infine, descriviamo l'isolamento delle oocisti generate dagli organoidi.

Studio dell'infezione da Cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3D mediante Microinjection

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Utilizzando questa procedura di purificazione e microiniezione della sporozoite, essenzialmente qualsiasi microbo ospite può essere studiato in qualsiasi sistema di organi derivati dai tessuti. Usando questa tecnica, possiamo controllare la quantità di sporozoiti puri iniettati nel lume organoide o nel lato apicico dell'organoide. Per purificare le sporozoiti di C.parvum, trasferire l'oocista in un tubo da 15 millilitri e rimondere le cellule a una concentrazione media di estasi una volta 10 al settimo oocista per millilitro.Dopo 60-90 minuti a 37 gradi Celsius, mescolare 14 millilitri di una soluzione di lavaggio appropriata con le oocisti e sedimentare le cellule per centrifugazione. Aspirare attentamente il supernatante per evitare di perdere oocisti e rimescolare il pellet sporozoico a un tre volte 10 al settimo oocista per uno o due millilitri di concentrazione DMEM. Per rimuovere eventuali oocici e gusci rimanenti, posizionare una canna da 10 millilitri dotata di un apparecchio portafiltro da 47 millilitri dotato di un filtro in policarbonato di dimensioni di pori di tre micrometri in un tubo da 15 millilitri a quattro gradi Celsius.Aggiungere 7,5 millilitri della sospensione di sporozoite all'assieme del filtro. Quando l'intero volume è passato attraverso il colino per gravità, lavare tutte le cellule rimanenti attraverso il colino con altri 7,5 millilitri di DMEM. Quando tutto il lavaggio è passato attraverso il colino, raccogliere la sospensione di sporozoite filtrata per centrifugazione per 10 minuti ed etichettare il pellet in 50-100 microlitri di un apposito mezzo di coltura organoide, integrato con colorante verde veloce allo 0,05%, e L-glutatione, betaina, L-cisteina, acido linoleico e taurina contenente tampone riducente.Per microiniettare i parassiti nel lato apicale di un organoide 3D, utilizzare prima un estrattore di micropipette per preparare i capillari di iniezione di vetro. Utilizzare le forcep per tagliare la punta del capillare a un diametro da nove a 12 micrometri per consentire un facile flusso di sporozoiti o oocici, se si sceglie di iniettare direttamente oocista, e utilizzare punte di micro-caricatore per riempire ogni capillare con un veloce colorante verde etichettato o sospensione di sporozoite. Quindi, caricare il primo capillare riempito di sporozoite in un microiniettore e utilizzare un microscopio invertito con un ingrandimento 5x e una pressione costante per microiniettare da 100 a 200 nanolitri della sospensione in ogni organoide.Il protocollo di escystation provoca il rilascio di sporozoiti da circa il 70 all'80% delle oocici. Pertanto, è essenziale filtrare i gusci di oocista rimanenti attraverso una filtrazione di tre micrometri. Rimuovere quasi il 100% delle oocista non eccitate.Inoltre, l'aggiunta di un colorante verde aiuta a garantire l'iniezione di tutti gli organoidi e consente la visualizzazione degli organoidi iniettati per almeno 24 ore dopo l'iniezione. Sebbene questo sia un metodo ben praticato, la microscopia elettronica a scansione può essere utilizzata per garantire che il processo di escystation non abbia danneggiare le sporozoiti o le oocici. L'iniezione di quantità uguali di oocista nel lume organoide può essere confermata visivamente da una semplice imaging microscopica.I test di immunofluorescenza possono anche essere utilizzati per esplorare i tipi di cellule infettate dal Cryptosporidium. Dopo che gli organoidi differenziati sono stati infettati per cinque giorni, la presenza di sporozoiti all'interno delle oocista può essere confermata asciugando una porzione di oocista su uno scivolo adesivo, fissando gli oocici con metanolo e combinando la colorazione DAPI con un anticorpo adatto specifico per oocista. Per ottenere i massimi risultati, utilizzare oocista fresco, utilizzare lo stesso capillare per tutte le iniezioni e cambiare il supporto ogni giorno dopo l'iniezione.Utilizzando questa tecnica, vari laboratori stanno iniziando a utilizzare organoidi per studiare le interazioni ospite-microbo. Stiamo studiando commensals e altri agenti patogeni in contesti di microcoltura organoide simili. Poiché cryptosporidium è un parassita umano, è importante eseguire questi esperimenti secondo le normative di sicurezza di livello 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

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