Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

Dit project ontving financiering uit het I-CORE-programma van het plannings-en budgetterings Comité en de Israel Science Foundation (Grant nr. 152/11), Marie Curie re-integratie subsidie nr. PCIG11-GA-2012-321675, en van het Horizon 2020 onderzoeks-en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 664918-MRG-grammatica.

1. voorbereiding van het systeem
<ol><li>Ontwerp van binding-site plasmiden
	<ol>
<li>Ontwerp de binding site cassette zoals afgebeeld in Figuur 1. Elke minigene bevat de volgende delen (5 ' tot 3 '): Eagl restriction site, ∼ 40 basissen van het 5 ' einde van het kanamycine (kan) Verzets gen, pLac-Ara Promoter, ribosoom binding site (RBS), aug van het mcherry gen, een spacer (δ), een RBP binding site, 80 bases van de 5 ' van het mCherry-gen en een ApaLI-beperkings site....

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

De in dit artikel beschreven methode vergemakkelijkt kwantitatieve in vivo meting van RBP-RNA bindingsaffiniteit in E. coli cellen. Het protocol is relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van geavanceerde machines, en data-analyse is eenvoudig. Bovendien worden de resultaten onmiddellijk geproduceerd, zonder de relatief lange wachttijd in verband met de volgende generatie sequencing (NGS) resultaten.
Een beperking van deze methode is dat het alleen in bacteriël...

RNA binding protein (RBP)-gebaseerde post-transcriptionele regulatie, specifiek karakteriseren van de interactie tussen Rbp's en RNA, is in de afgelopen decennia uitgebreid bestudeerd. Er zijn meerdere voorbeelden van translationele down-regulatie in bacteriën afkomstig van rbps remming, of rechtstreeks concurreren met, ribosoom binding1,2,3. Op het gebied van de synthetische biologie, RBP-RNA interacties ontstaan als een belangrijk instrument voor het ontwerp van op transcriptie gebaseerde genetische circuits4,5. Daarom is er een toename van de vraag naar karakterisering van zulke RBP-RNA-interacties in een cellulaire context.
De meest voorkomende methoden voor het bestuderen van eiwit-RNA-interacties zijn de elektroforetisch Mobility Shift assay (EMSA)6, die beperkt is tot in vitro-instellingen, en verschillende pull-down testen7, inclusief de clip methode8,9 . Hoewel dergelijke methoden de ontdekking van de Novo RNA binding sites mogelijk maken, lijden ze aan nadelen zoals arbeidsintensieve protocollen en dure Deep sequence-reacties en kunnen ze een specifiek antilichaam voor RBP-pull-down vereisen. Vanwege de gevoelige aard van RNA in zijn omgeving, kunnen veel factoren invloed hebben op RBP-RNA-interacties, waarbij het belang van het ondervragen van RBP-RNA-binding in de cellulaire context wordt benadrukt. Zo hebben wij en anderen aanzienlijke verschillen aangetoond tussen de RNA-structuren in vivo en in vitro10,11.
Op basis van de aanpak van een eerdere studie12, hebben we onlangs10 aangetoond dat bij het plaatsen van vooraf ontworpen binding sites voor de capside rbps van de bacteriofagen ga13, ms214, PP7-15en qβ16 in de Vertaal initiatie regio van een reporter mRNA, reporter expressie wordt sterk onderdrukt. We presenteren een relatief eenvoudige en kwantitatieve methode op basis van dit repressie fenomeen om de affiniteit tussen Rbp's en hun corresponderende RNA bindingsplaatss in vivo te meten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

In de initiatie stap van eiwit vertaling bindt het ribosoom aan het initiatie gebied van de mRNA. Initiatie van de vertaling kan worden geblokkeerd door binding van een RNA bindend eiwit (RBP) aan de initiatie regio van de mRNA, die interfereert met ribosoom binding. In de gepresenteerde methode gebruiken we dit blokkerende fenomeen om de bindende affiniteit van rbp's te kwantificeren naar hun verwant en niet-verwant binding sites. Om dit te doen, voegen we een test binding site in het initiatie gebied van een reporter mRNA en induceren de uitdrukking van de test RBP. In het geval van RBP-RNA binding, observeerden we een sigmoïdale onderdrukking van de reporter expressie als een functie van RBP-concentratie. In het geval van geen affiniteit of een zeer lage affiniteit tussen de bindingsplaats en de RBP, werd geen significante onderdrukking waargenomen. De methode wordt uitgevoerd in levende bacteriële cellen, en vereist geen dure of verfijnde machines. Het is nuttig voor het kwantificeren en vergelijken van de bindende verwantschap van verschillende Rbp's die functioneel zijn in bacteriën tot een set van ontworpen binding sites. Deze methode kan ongeschikt zijn voor binding sites met een hoge structurele complexiteit. Dit is te wijten aan de mogelijkheid van onderdrukking van de ribosomale initiatie door complexe mRNA-structuur in de afwezigheid van RBP, wat zou resulteren in een lagere basale reporter genexpressie, en dus minder waarneembare reporter onderdrukking bij RBP binding.

De gepresenteerde methode maakt gebruik van de concurrentie tussen een RBP en het ribosoom voor binding aan het mRNA-molecuul (Figuur 1). Deze competitie wordt weerspiegeld door het verminderen van mCherry niveaus als een functie van verhoogde productie van RBP-mCerulean, als gevolg van toenemende concentraties van inductor. In het geval van toenemende mCerulean fluorescentie, zonder significante veranderingen in mCherry, wordt een gebrek aan RBP-binding afge...

Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Karakterisering van eiwitbinding aan RNA in vivo blijft een grote uitdaging vanwege de complexe aard van RNA en de vele factoren die de interactie met eiwitten beïnvloeden. RNA binding eiwit of RBP-RNA affiniteit wordt gemeten in levende bacteriële cellen. Aangezien de cellulaire omgeving zowel de structuur van RNA als de resulterende RBP-RNA binding beïnvloedt, is het meten van de affiniteit in vivo cruciaal voor het begrijpen van dergelijke interacties in natuurlijke systemen.Het geheim van succes zit hem in het ontwerp van de plasmiden. Het ontwerp moet gebruik maken van verschillende golven van delta en voorkomen dat het inbrengen van stop codons en frameshift mutaties. Begin dit protocol door het ontwerpen van de binding site cassette.Elk minigen bevat een EagI-beperkingsplaats, 40 basissen van het vijfste hoofdeinde van het kanamycine-resistentiegen, de pLac/Ara-promotor, de ribosoombindingsplaats, AUG van het mCherry-gen, een afstandsman, een RBP-bindingsplaats, 80 basen van het vijfste eind van het mCherry-gen en een ApaLI-beperkingsplaats. Om het slagingspercentage van de test te verhogen, ontwerpt u drie bindende sitecassettes voor elke bindingsplaats met afstandhouders bestaande uit ten minste één, twee en drie basissen. Dubbel verteren zowel de mini-genen en de doelvector met EagI HF en ApaLI voor het uitvoeren van kolomzuivering van de digesten.Ligate de verteerde minigenen aan de bindingsplaats ruggengraat met de rest van de mCherry reporter gen, terminator en een kanamycine resistentie gen. Zet vervolgens de ligatieoplossing om in Escherichia coli top 10 cellen. Na het identificeren van positieve transformatoren via Sanger sequencing, op te slaan gezuiverde plasmiden in de 96 goed formaat op min 20 graden Celsius.Ook op te slaan de bacteriële stammen als glycerol voorraden in de 96 goed formaat op min 80 graden Celsius. Aangepaste volgorde van de vereiste RBP sequentie ontbreekt een stop codon als een dubbelstrengs DNA mini-gen met beperking sites aan de uiteinden. Zet de voorbereide plasmiden om in chemisch bevoegde bacteriële cellen die al een RBP mCerulean plasmide bevatten.Om tijd te besparen, plaat de cellen met behulp van een acht kanaal pipetter op acht baanplaten met Luria-Bertani agar met relevante antibiotica. Kolonies moeten verschijnen in 16 uur op 37 graden Celsius. Selecteer een enkele kolonie voor elke dubbele transformator en breng over op 48 putplaten met 1,5 milliliter LB met geschikte antibiotica.Laat de cellen groeien over een periode van 18 uur bij 37 graden Celsius schudden bij 250 RPM. Bewaar de overnachtingen als glycerol voorraden op min 80 graden Celsius in 96 goed platen. In de ochtend programmeert u de robot om 180 microliters van semi-porie medium of SPM op te warmen in 96 putplaten.Programmeer de robot om de inducerplaat voor te bereiden. In een schone 96 put plaat, bereiden putten met SPM bestaande uit 95%BA en 5%LB. Het aantal putten komt overeen met het gewenste aantal inducerconcentraties.Voeg C4-HSL toe aan de putten in de inducerplaat die de hoogste inducerconcentratie zal bevatten. Programmeer vervolgens de robot om het medium van elk van de hoogste concentratieputten serieel te verdunnen in 23 lagere concentraties variërend van nul tot 218 nanomolar. Het volume van elke inducatorverdunning moet voldoende zijn voor alle stammen.Om de nachtelijke stammen te verdunnen, programmeer de robot om te verdunnen met een factor 10 door 20 microliter bacteriën te mengen met 180 microliter SPM in 48 putplaten. Verdun vervolgens opnieuw met een factor 10 door 20 microliter uit de verdunde oplossing in de voorgeprepareerde stamplaat te brengen die geschikt is voor fluorescerende meting. Nu programma de robot om de verdunde inducer toe te voegen van de inducer plaat aan de 96 goed platen met de verdunde stammen volgens de uiteindelijke concentraties.Schud de 96 goed platen op 37 graden Celsius gedurende zes uur. Gedurende die tijd, metingen van de optische dichtheid of OD op 595 nanometer evenals mCherry en mCerulean fluorescentie via een plaatlezer om de 30 minuten. Voor normalisatiedoeleinden meet u de groei van SPM zonder cellen.Hier worden driedimensionale percelen getoond voor een positieve stam. De percelen tonen ruwe OD niveaus, mCerulean fluorescentie, en mCherry fluorescentie als functie van tijd en inducer concentratie. mCerulean steady-state expressie niveaus werden berekend voor elke inducer concentratie voor zowel de positieve als negatieve stammen.De mCherry productiesnelheid werd ook berekend voor elke inducer concentratie voor zowel positieve als negatieve stammen. mCherry productiesnelheid werd uitgezet als een functie van gemiddelde mCerulean fluorescentie gemiddeld over twee biologische duplicaten voor twee stammen. De pasvorm KRBP met behulp van de montageformule wordt getoond voor de positieve stam die een specifieke bindende respons vertoont.Voor de negatieve stam werd geen KRBP-waarde geëxtraheerd. Genormaliseerde dosisresponscurven werden bepaald voor 30 verschillende stammen op basis van twee RBPs als 10 bindingsplaatsen op verschillende locaties. Er worden drie soorten reacties waargenomen, hoge affiniteit, lage affiniteit en geen affiniteit.Hier worden kwantitatieve KRBP-resultaten getoond voor twee RBPs, MS2-laageiwit en PP7-laageiwit met 10 verschillende bindingsitecassettes. Dosisresponscurven voor MS2-laageiwit met een gemuteerde bindingsplaats op vier verschillende locaties worden hier getoond om het effect van de mutante afstand op de productie van mCherry aan te tonen. De volgorde van de geteste gemuteerde bindingsplaats wordt weergegeven.Het is belangrijk om een structurele techniek te gebruiken, zoals vormzoeken om chemisch sonde van de structuur van het eiwit-RNA complex en te visualiseren welke mRNA-regio's worden beïnvloed door RNA binding. Onlangs hebben we deze techniek op een hoge doorvoermanier gebruikt om tegelijkertijd de affiniteit van de RBP's te meten op 10.000 bindingssites.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kwantificering van buikpigmentatie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...