Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

Dieses Projekt wurde aus dem I-CORE-Programm des Planungs- und Budgetierungsausschusses und der Israel Science Foundation (Grant No. 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675 und aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 664918 - MRG-Grammar.

1. Systemvorbereitung
<ol><li>Design von Bindungs-Standort-Plasmiden
	<ol>
<li>Entwerfen Sie die Bindungsplatzkassette wie in Abbildung 1dargestellt. Jedes Minigen enthält die folgenden Teile (5' bis 3'): Eagl-Restriktionsstelle, 40 Basen des 5'-Endes des Kanamycin-Resistenzgens, pLac-Ara-Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS), AUG des mCherry-Gens, ein Abstandsabstand , eine RBP-Bindungsstelle, 80 Basen des 5'-Ens des mCherry-Gens und einer ApaLI-Einschränkungsseite.<b...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

Die in diesem Artikel beschriebene Methode erleichtert die quantitative In-vivo-Messung der RBP-RNA-Bindungsaffinität in E. coli-Zellen. Das Protokoll ist relativ einfach und kann ohne den Einsatz ausgeklügelter Maschinen durchgeführt werden, und die Datenanalyse ist einfach. Darüber hinaus werden die Ergebnisse sofort erstellt, ohne die relativ lange Wartezeit, die mit den Ergebnissen der Next Generation Sequencing (NGS) verbunden ist.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass...

Die RNA-bindende Protein-basierte posttranskriptionelle Regulation, speziell die Charakterisierung der Interaktion zwischen RBPs und RNA, wurde in den letzten Jahrzehnten ausgiebig untersucht. Es gibt mehrere Beispiele für translationale Down-Regulierung bei Bakterien, die von RBPs stammen, die Ribosombindung1,2,3hemmen oder direkt mit ihnen konkurrieren. Im Bereich der synthetischen Biologie entwickeln sich RBP-RNA-Wechselwirkungen zu einem bedeutenden Werkzeug für die Entwicklung von Transkriptionsbasierten genetischen Schaltkreisen4,5. Daher steigt die Nachfrage nach Charakterisierung solcher RBP-RNA-Wechselwirkungen im zellulären Kontext.
Die gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen sind der elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA)6, der auf In-vitro-Einstellungen beschränkt ist, und verschiedene Pull-Down-Assays7, einschließlich der CLIP-Methode8,9 . Während solche Methoden die Entdeckung von de novo RNA-Bindungsstellen ermöglichen, leiden sie unter Nachteilen wie arbeitsintensiven Protokollen und teuren tiefen Sequenzierungsreaktionen und erfordern möglicherweise einen spezifischen Antikörper für RBP-Pull-down. Aufgrund der anfälligen Natur der RNA für ihre Umgebung können viele Faktoren RBP-RNA-Wechselwirkungen beeinflussen, was die Bedeutung der Rekation der RBP-RNA-Bindung im zellulären Kontext unterstreicht. Zum Beispiel haben wir und andere signifikante Unterschiede zwischen RNA-Strukturen in vivo und in vitro10,11gezeigt.
Basierend auf dem Ansatz einer früheren Studie12, haben wir vor kurzem10 gezeigt, dass bei der Platzierung vorgefertigter Bindungsstellen für die Kapsid-RBPs aus den Bakteriophagen GA13, MS214, PP715und Q.16 in der ÜbersetzungInitiationsregion eines Reporters mRNA, Reporter Ausdruck wird stark unterdrückt. Wir präsentieren eine relativ einfache und quantitative Methode, basierend auf diesem Repressionsphänomen, um die Affinität zwischen RBPs und ihrer entsprechenden RNA-Bindungsstelle in vivo zu messen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

Im Initiationsschritt der Proteintranslation bindet das Ribosom an den Initiationsbereich der mRNA. Die Translationsinitiation kann durch Bindung eines RNA-bindenden Proteins (RBP) an den Initiationsbereich der mRNA blockiert werden, der die Ribosome-Bindung stört. In der vorgestellten Methode nutzen wir dieses Blockierungsphänomen, um die Bindungsaffinität von RBPs zu ihren kognitierten und nicht kognierten Bindungsstellen zu quantifizieren. Dazu fügen wir eine Testbindungsstelle im Initiationsbereich einer Reporter-mRNA ein und induzieren die Expression des Test-RBP. Bei der RBP-RNA-Bindung beobachteten wir eine sigmoidale Unterdrückung des Reporterausdrucks als Funktion der RBP-Konzentration. Bei no-affinity oder sehr geringer Affinität zwischen Bindungsseite und RBP wurde keine signifikante Repression beobachtet. Die Methode wird in lebenden Bakterienzellen durchgeführt und erfordert keine teuren oder ausgeklügelten Maschinen. Es ist nützlich für die Quantifizierung und den Vergleich zwischen den Bindungsaffinitäten verschiedener RBPs, die in Bakterien funktionsfähig sind, zu einer Reihe von entworfenen Bindungsstellen. Diese Methode kann für die Bindung von Standorten mit hoher struktureller Komplexität ungeeignet sein. Dies ist auf die Möglichkeit der Unterdrückung der ribosomalen Initiation durch komplexe mRNA-Struktur in Abwesenheit von RBP zurückzuführen, was zu einer niedrigeren Basalreporter-Genexpression und damit zu einer weniger beobachtbaren Reporterrepression auf DIE RBP-Bindung führen würde.

Die vorgestellte Methode nutzt den Wettbewerb zwischen einem RBP und dem Ribosom zur Bindung an das mRNA-Molekül (Abbildung 1). Dieser Wettbewerb spiegelt sich in sinkenden mCherry-Spiegeln als Funktion der erhöhten Produktion von RBP-mCerulean wider, aufgrund steigender Konzentrationen von Induktoren. Im Falle einer zunehmenden mCerulean-Fluoreszenz, ohne signifikante Änderungen in mCherry, wird ein Mangel an RBP-Bindung abgeleitet. Repräsentative Ergebn...

Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Bei dieser Methode quantifizieren wir die Bindungsaffinität von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) zu kognazierenden und nicht-kogatierten Bindungsstellen mit einem einfachen, live, Reporter-Assay in Bakterienzellen. Der Test basiert auf der Unterdrückung eines Reportergens.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Die Charakterisierung der Proteinbindung an RNA in vivo bleibt aufgrund der komplexen Natur der RNA und der vielen Faktoren, die ihre Interaktion mit Proteinen beeinflussen, eine große Herausforderung. RNA-Bindungsprotein oder RBP-RNA-Affinität wird in lebenden Bakterienzellen gemessen. Da die zelluläre Umgebung sowohl die Struktur der RNA als auch die daraus resultierende RBP-RNA-Bindung beeinflusst, ist die Messung der Affinität in vivo entscheidend für das Verständnis solcher Wechselwirkungen in natürlichen Systemen.Das Geheimnis des Erfolgs liegt in der Gestaltung der Plasmide. Das Design sollte mehrere Deltawellen verwenden und das Einfügen von Stop-Codons und Frameshift-Mutationen vermeiden. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Bindungswebsitekassette entwerfen.Jedes Mini-Gen enthält eine EagI-Restriktionsstelle, 40 Basen vom fünf Hauptende des Kanamycin-Resistenzgens, den pLac/Ara-Promotor, die Ribosome-Bindungsstelle, AUG des mCherry-Gens, einen Abstandsraum, eine RBP-Bindungsstelle, 80 Basen vom fünf Primende des mCherry-Gens und eine ApaLI-Einschränkungsstelle. Um die Erfolgsrate des Assays zu erhöhen, entwerfen Sie drei Bindungsplatzkassetten für jede Bindungsstelle mit Abstandshaltern, die aus mindestens einer, zwei und drei Basen bestehen. Verdauen Sie sowohl die Minigene als auch den Zielvektor mit EagI HF und ApaLI, bevor Sie die Kolonnenreinigung der Digests durchführen.Ligate die verdauten Mini-Gene an das Bindungsstellen-Backbone, das den Rest des mCherry-Reportergens, den Terminator und ein Kanamycin-Resistenzgen enthält. Verwandeln Sie dann die Ligationslösung in Escherichia coli Top 10 Zellen. Nach der Identifizierung positiver Transformanten mittels Sanger-Sequenzierung speichern Sie gereinigte Plasmide im 96-Well-Format bei minus 20 Grad Celsius.Bewahren Sie die Bakterienstämme auch als Glycerinbestände im 96-Gut-Format bei minus 80 Grad Celsius auf. Kundenspezifische Reihenfolge die erforderliche RBP-Sequenz ohne Stop-Codon als doppelsträngiges DNA-Mini-Gen mit Restriktionsstellen an den Enden. Verwandeln Sie die hergestellten Plasmide in chemisch kompetente Bakterienzellen, die bereits ein RBP mCerulean Plasmid enthalten.Um Zeit zu sparen, platten Sie die Zellen mit einem Achtkanal-Pipetter auf acht Spurplatten, die Luria-Bertani-Agar mit relevanten Antibiotika enthalten. Kolonien sollten in 16 Stunden bei 37 Grad Celsius erscheinen. Wählen Sie für jedes Doppel-Transformant eine einzelne Kolonie aus und übertragen Sie sie auf 48 Wellplatten mit 1,5 Millilitern LB mit entsprechenden Antibiotika.Wachsen Sie die Zellen über einen Zeitraum von 18 Stunden bei 37 Grad Celsius Schütteln bei 250 RPM. Lagern Sie die Übernachtungen als Glycerinvorräte bei minus 80 Grad Celsius in 96 Brunnenplatten. Am Morgen programmieren Sie den Roboter, um 180 Mikroliter Halbporenmedium oder SPM in 96 Brunnenplatten zu erwärmen.Programmieren Sie den Roboter, um die Induktorplatte vorzubereiten. In einer sauberen 96 Brunnenplatte, bereiten Brunnen mit SPM bestehend aus 95%BA und 5%LB. Die Anzahl der Brunnen entspricht der gewünschten Anzahl von Induktorkonzentrationen.Fügen Sie C4-HSL zu den Brunnen in der Induktorplatte hinzu, die die höchste Induktorkonzentration enthalten. Als nächstes programmieren Sie den Roboter, um das Medium von jedem der höchsten Konzentrationsbrunnen seriell in 23 niedrigere Konzentrationen von null bis 218 Nanomolar zu verdünnen. Das Volumen jeder Induktorverdünnung sollte für alle Stämme ausreichen.Um die Nachtstämme zu verdünnen, programmieren Sie den Roboter, um den Faktor 10 zu verdünnen, indem Sie 20 Mikroliter Bakterien mit 180 Mikroliter SPM in 48 Brunnenplatten mischen. Dann wieder um den Faktor 10 verdünnen, indem man 20 Mikroliter aus der verdünnten Lösung in die vorgefertigte Stammplatte für die Fluoreszenzmessung nimmt. Programmieren Sie nun den Roboter, um den verdünnten Induktor von der Induktorplatte zu den 96 Brunnenplatten mit den verdünnten Stämmen entsprechend den Endkonzentrationen hinzuzufügen.Schütteln Sie die 96 Brunnenplatten bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden. In dieser Zeit können Sie die optische Dichte oder OD mit 595 Nanometern sowie die mCherry- und mCerulean-Fluoreszenz alle 30 Minuten über einen Plattenleser messen. Messen Sie für Normalisierungszwecke das Wachstum von SPM, ohne dass Zellen hinzugefügt werden.Hier sind dreidimensionale Diagramme für eine positive Dehnung dargestellt. Die Plots zeigen rohe OD-Werte, mCerulean-Fluoreszenz und mCherry-Fluoreszenz als Funktion der Zeit und Induktorkonzentration. mCerulean Steady-State-Expressions-Levels wurden für jede Induktorkonzentration sowohl für die positiven als auch für die negativen Stämme berechnet.Die mCherry-Produktionsrate wurde auch für jede Induktorkonzentration für positive und negative Stämme berechnet. mCherry Produktionsrate wurde als Funktion der mittleren mCerulean Fluoreszenz gemittelt über zwei biologische Duplikate für zwei Stämme. Für die positive Dehnung mit einer spezifischen Bindungsreaktion wird die Passform KRBP unter Verwendung der Fitting-Formel angezeigt.Für den negativen Stamm wurde kein KRBP-Wert extrahiert. Normalisierte Dosis-Wirkungskurven wurden für 30 verschiedene Stämme bestimmt, basierend auf zwei RBPs als 10 Bindungsstellen an verschiedenen Standorten. Drei Arten von Antworten werden beobachtet, hohe Affinität, geringe Affinität und keine Affinität.Hier sind quantitative KRBP-Ergebnisse für zwei RBPs, MS2-Beschichtungsprotein und PP7-Beschichtungsprotein mit 10 verschiedenen Bindungsplatzkassetten zu sehen. Dosis-Wirkungs-Kurven für MS2-Beschichtungsprotein mit einer mutierten Bindungsstelle an vier verschiedenen Standorten werden hier gezeigt, um die Wirkung des Mutantenabstandes auf die mCherry-Produktion zu demonstrieren. Die Reihenfolge der getesteten mutierten Bindungsstelle wird angezeigt.Es ist wichtig, eine Strukturtechnik wie Die Form zu verwenden, um die Struktur des Protein-RNA-Komplexes chemisch zu erforschen und zu visualisieren, welche mRNA-Regionen von der RNA-Bindung betroffen sind. Kürzlich haben wir diese Technik in einer Art und Weise mit hohem Durchsatz verwendet, um gleichzeitig die Affinität der RBPs zu 10.000 Bindungsstellen zu messen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Forschung

Genetik

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...