Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית ה-I-CORE של ועדת התכנון והתקצוב והקרן הישראלית למדעים (גרנט No. 152/11), מארי קירי שילוב מחדש של המענק לא. PCIG11-GA-2012-321675, ומאופק האיחוד האירופי 2020 תוכנית מחקר וחדשנות תחת הסכם מענק מס ' 664918-MRG-דקדוק.

1. הכנת המערכת
<ol><li>תכנון הפלמידים באתר
	<ol>
<li>עצב את קלטת אתר האיגוד כמתואר באיור 1. כל minigene מכיל את החלקים הבאים (5 ' עד 3 '): הגבלת האתר, ∼ 40 בסיסים של 5 ' סוף של kanamycin ' גן ההתנגדות, פנקייק-Ara מקדם, ריבוחלק באתר מחייב (RBS), אוג של הגן mCherry, מרווח (δ), אתר כריכת RBP, 80 בסיסים של 5 ' ס...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

השיטה המתוארת במאמר זה מקלה כמותית במדידה vivo של RBP-RNA הזיקה הקשירה בתאים E. coli . הפרוטוקול קל יחסית וניתן להתנהל ללא שימוש במכונות מתוחכמות, וניתוח נתונים הוא פשוט. כמו-כן, התוצאות מיוצרות מיד, ללא הזמן ההמתנה הארוך המשויך לתוצאות רצף הדור הבא (NGS).
מגבלה אחת לשיטה זו היא שזה...

ה-RNA כריכת חלבון (RBP) מבוסס לאחר ההמרה רגולציה, אפיון במיוחד של האינטראקציה בין Rbp ו-RNA, נחקרו בהרחבה בעשורים האחרונים. ישנן מספר דוגמאות של התקנה למטה הטרנסלtional בחיידקים שמקורם rbps עיכוב, או מתחרה ישירות עם, ריבוכמה קשירה1,2,3. בתחום הביולוגיה הסינתטית, האינטראקציות של rbp-RNA מתפתחות ככלי משמעותי לעיצוב המעגלים הגנטיים המבוססים על תמלול4,5. לכן, קיימת עלייה בביקוש לאפיון של אינטראקציות RBP-RNA כגון בהקשר הסלולר.
השיטות הנפוצות ביותר ללימוד אינטראקציות של חלבון-RNA הן שיטת השינוי בשיטת הניידות האלקטרופיניטית (emsa)6, המוגבלת להגדרות חוץ-גופית, ושונות משיכה מספר7, כולל שיטת הקליפ8,9 . בעוד שיטות כאלה לאפשר גילוי של אתרי האיגוד של דה נובו RNA, הם סובלים מחסרונות כגון פרוטוקולים עתירי עבודה ותגובות ברצף יקר והוא עשוי לדרוש נוגדן ספציפי עבור RBP למשוך למטה. בשל האופי הפגיע של RNA לסביבתו, גורמים רבים יכולים להשפיע על אינטראקציות RBP-RNA, תוך שימת דגש על החשיבות של חקירת מחייב RBP-RNA בהקשר הסלולר. לדוגמא, אנחנו ואחרים הדגמנו הבדלים משמעותיים בין מבני RNA בvivo ובתוך מבחנה10,11.
בהתבסס על הגישה של המחקר הקודם12, לאחרונה הפגינו10 כי כאשר ממקמים מעוצב מראש אתרי קשירה עבור capsid rbps מתוך בקטביאז GA13, MS214, PP715, ו Qβ16 ב התרגום האזור של כתבת mRNA, ביטוי העיתונאי הוא מודחק מאוד. אנו מציגים שיטה פשוטה יחסית וכמותית, המבוססת על תופעה זו של דיכוי, כדי למדוד את הזיקה בין RBPs לאתר המקבילשל ה -RNA שלהם ב-vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

בשלב החניכה של תרגום חלבונים, הריבוחלק נקשר לאזור החניכה של mRNA. אתחול תרגום ניתן לחסום על ידי איגוד של חלבון כריכת RNA (RBP) לאזור החניכה של mRNA, אשר מפריעה עם ריבוכמה הכריכה. בשיטה המוצגת, אנו מנצלים את תופעת החסימה הזאת לכמת את הזיקה המחייב של rbps לאתרים שאינם מחייבים קנצוני שלהם. כדי לעשות זאת, אנו מכניסים אתר מחייב בדיקה באזור החניכה של העיתונאי mRNA ולגרום לביטוי RBP הבדיקה. במקרה של RBP-RNA כריכה, הבחנו דיכוי החתימה של ביטוי הכתב כפונקציה של ריכוז RBP. במקרה של חוסר אהדה או זיקה נמוכה מאוד בין אתר האיגוד ל-RBP, לא נצפתה דיכוי משמעותי. השיטה מבוצעת בתאי חיידקי חיים, ואינה דורשת מכונות יקרות או מתוחכמות. היא שימושית לכימות והשוואה בין הקשרים המחייבים של האיגוד של RBPs שונים הפונקציונליים בחיידקים לקבוצה של אתרי איגוד מעוצבים. שיטה זו עשויה להיות לא מתאימה לאתרי איגוד בעלי מורכבות מבנית גבוהה. זאת בשל האפשרות של דיכוי של חניכה הריבוזומלית על ידי מבנה mRNA מורכב בהעדר RBP, אשר יגרום הביטוי הנמוך ביותר גנים כתבת בסיס, ולכן הדיכוי כתב פחות הנצפה על הכריכה RBP.

השיטה המוצגת מנצלת את התחרות בין RBP לבין הריבוחלק לכריכה למולקולה mRNA (איור 1). תחרות זו משתקפת על ידי הפחתת רמות mCherry כפונקציה של ייצור מוגבר של RBP-mCerulean, בשל ריכוזי הגוברת של הסליל. במקרה של הגדלת mCerulean פלואורסצנטית, ללא שינויים משמעותיים ב-mCherry, חוסר של כריכת ...

Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

אפיון חלבון מחייב RNA in vivo נשאר אתגר גדול בשל האופי המורכב של RNA ואת הגורמים הרבים המשפיעים על האינטראקציה שלה עם חלבונים. חלבון מחייב RNA או זיקה RBP-RNA נמדד בתוך תאים חיידקיים חיים. מאז הסביבה התאית משפיעה הן על המבנה של RNA והן על איגוד RBP-RNA וכתוצאה מכך, מדידת הזיקה ב- vivo חיונית להבנת אינטראקציות כאלה במערכות טבעיות.סוד ההצלחה הוא בעיצוב הפלסמידים. העיצוב צריך להשתמש במספר גלים של דלתא ולהימנע החדרת קודונים להפסיק מוטציות מסגרות. התחל פרוטוקול זה על-ידי עיצוב קלטת אתר האיגוד.כל גן מיני מכיל אתר הגבלת EagI, 40 בסיסים מחמשת הקצה העיקרי של גן ההתנגדות לקאנאמיצין, מקדם pLac/Ara, אתר כריכת הריבוזום, AUG של הגן mCherry, מרחב, אתר כריכת RBP, 80 בסיסים מחמשת החלקים הראשונים של הגן mCherry, ואתר הגבלת ApaLI. כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של ההתראה, תכנן שלוש קלטות אתר מחייבות עבור כל אתר איגוד עם רווחים המורכבים לפחות מבסיס אחד, שניים ושלושה בסיסים. לעכל פעמיים הן את הגנים מיני ואת וקטור היעד עם EagI HF ו ApaLI לפני ביצוע טיהור עמודה של העיכול.Ligate הגנים מיני מתעכל עמוד השדרה של האתר מחייב המכיל את שאר הגן כתב mCherry, שליחות קטלנית ותנאם עמידות kanamycin. לאחר מכן להפוך את פתרון קשירה לתוך Escherichia coli העליון 10 תאים. לאחר זיהוי שנאים חיוביים באמצעות רצף סנגר, לאחסן פלסמידים מטוהרים בפורמט 96 גם במינוס 20 מעלות צלזיוס.גם לאחסן את הזנים חיידקי כמו מניות גליצרול בפורמט 96 גם במינוס 80 מעלות צלזיוס. סדר מותאם אישית את רצף RBP הנדרש חסר קודון עצירה כגן מיני DNA כפול תקוע עם אתרי הגבלה בקצוות. הפוך את הפלסמידים המוכנים לתאי חיידקים מוכשרים מבחינה כימית שכבר מכילים פלסמיד RBP mCerulean.כדי לחסוך זמן, צלחת התאים באמצעות צינור שמונה ערוצים על שמונה לוחות נתיב המכילים לוריא-ברתאני אגר עם אנטיביוטיקה רלוונטית. מושבות אמורות להופיע בעוד 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. בחר מושבה אחת עבור כל טרנספורמנט כפול ולהעביר 48 צלחות באר המכיל 1.5 מיליליטר של LB עם אנטיביוטיקה מתאימה.לגדל את התאים על פני תקופה של 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 250 סל"ד. לאחסן את הלילה כמו מניות גליצרול במינוס 80 מעלות צלזיוס ב 96 צלחות באר. בבוקר, לתכנת את הרובוט לחמם 180 microliters של בינוני חצי נקבוביות או SPM ב 96 צלחות גם.תכנת את הרובוט להכין את צלחת התמריצים. בצלחת נקייה של 96 בארות, הכינו בארות עם SPM המורכב מ-95% BA ו-5%LB. מספר בארות מתאים למספר הרצוי של ריכוזי inducer.הוסף C4-HSL ל בארות בצלחת inducer שיכיל את ריכוז inducer הגבוה ביותר. לאחר מכן, לתכנת את הרובוט כדי לדלל באופן סדרתי בינוני מכל בארות הריכוז הגבוה ביותר לתוך 23 ריכוזים נמוכים יותר החל אפס עד 218 nanomolar. הנפח של כל דילול מעורר צריך להיות מספיק עבור כל הזנים.כדי לדלל את זנים לילה, לתכנת את הרובוט לדלל על ידי גורם של 10 על ידי ערבוב 20 microliters של חיידקים עם 180 microliters של SPM ב 48 צלחות היטב. ואז לדלל שוב על ידי גורם של 10 על ידי לקיחת 20 microliters מהתספורת מדולל לתוך צלחת המתח מוכן מראש מתאים למדידת פלואורסצנט. עכשיו לתכנת את הרובוט להוסיף את inducer מדולל מן צלחת inducer כדי 96 צלחות גם עם זנים מדוללים על פי הריכוזים הסופיים.לנער את 96 צלחות באר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. במהלך תקופה זו, לקחת מדידות של צפיפות אופטית או OD ב 595 ננומטר, כמו גם mCherry ו mCerulean פלואורסצנטיות באמצעות קורא צלחת כל 30 דקות. למטרות נורמליזציה, למדוד צמיחה של SPM ללא תאים שנוספו.מוצגות כאן עלילות תלת מימדיות למתח חיובי. העלילות מתארות רמות OD גולמיות, פלואורסצנטיות אקרולית ו פלואורסצנטיות mCherry כפונקציה של זמן וריכוז מעורר. רמות ביטוי מצב יציב mCerulean חושבו עבור כל ריכוז inducer עבור זנים חיוביים ושליליים.קצב הייצור של mCherry חושב גם עבור כל ריכוז גורם עבור זנים חיוביים ושליליים. m אחוזי ייצור התווה כפונקציה של פלואורסצנטיות mCerulean ממוצע מעל שני כפילויות ביולוגיות עבור שני זנים. ההתאמה KRBP באמצעות הנוסחה המתאימה מוצגת עבור המתח החיובי המציג תגובת איגוד ספציפית.עבור הזן השלילי, לא מופק ערך KRBP. עקומות תגובה מינון מנורמל נקבעו עבור 30 זנים שונים המבוססים על שני RBPs כמו 10 אתרי איגוד במקומות שונים. שלושה סוגים של תגובות נצפו, זיקה גבוהה, זיקה נמוכה, ואין זיקה.מוצגות כאן תוצאות KRBP כמותיות עבור שני RBPs, חלבון מעיל MS2 וחלבון מעיל PP7 עם 10 קלטות אתר מחייבות שונות. עקומות תגובה מינון עבור חלבון מעיל MS2 עם אתר מחייב מוטציה בארבעה מקומות שונים מוצגים כאן כדי להדגים את ההשפעה של ריווח מוטנטים על ייצור mCherry. הרצף של אתר האיגוד שעבר מוטציה שנבדק מוצג.חשוב להשתמש בטכניקה מבנית כגון צורה המבקשים לחקור כימית את המבנה של קומפלקס החלבון-RNA ולהמחיש אילו אזורי mRNA מושפעים מחייב RNA. לאחרונה, השתמשנו בטכניקה זו באופן תפוקה גבוהה כדי למדוד בו זמנית את הזיקה של RBPs ל 10, 000 אתרי איגוד.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...