Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
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इस परियोजना की योजना और बजट समिति और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 152/11), मैरी क्यूरी पुन: एकीकरण अनुदान No. के आई-कोर कार्यक्रम से धन प्राप्त किया। PCIG11-GA- 2012-321675, और अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से संख्या 664918 - MRG-Grammar.

1. सिस्टम तैयारी
<ol><li>बाइंडिंग-साइट प्लाज्मिड का डिजाइन
	<ol>
<li>बाइंडिंग साइट कैसेट को चित्र 1में दर्शाए अनुसार डिजाइन करें। प्रत्येक minigene निम्नलिखित भागों में शामिल हैं (5' करने के लिए 3'): Eagl प?...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

इस अनुच्छेद में वर्णित विधि ई. कोलाई कोशिकाओं में आरबीपी-आरएनए बंधनात्मक संबंध के विवो माप में मात्रात्मक की सुविधा प्रदान करती है। प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत आसान है और परिष्कृत मशीनरी के उपयोग के बिन...

आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) आधारित पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, विशेष रूप से आरबीपी और आरएनए के बीच बातचीत की विशेषता, हाल के दशकों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। आरबीपीएस से निकलने वाले बैक्टीरिया में अनुवादात्मक डाउन-विनियमन के कई उदाहरण हैं जो बाधा उत्पन्न करते हैं, या सीधे प्रतिस्पर्धा करते हैं, राइबोसोम बंधन1,2,3. संश् लेषित जीव विज्ञान के क्षेत्र में आरबीपी-आर.एन.ए. अन्तरक्रिया प्रतिलेखन-आधारित आनुवंशिक परिपथों4,5के डिजाइन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभर रहे हैं। इसलिए, एक सेलुलर संदर्भ में ऐसे आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन की विशेषता की मांग में वृद्धि हुई है।
प्रोटीन-आरएनए बातचीत के अध्ययन के लिए सबसे आम तरीके इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता पारी परख (EMSA)6, जो इन विट्रो सेटिंग्स में करने के लिए सीमित है, और विभिन्न पुल-डाउन परख7, CLIP विधि8सहित,9 . जबकि इस तरह के तरीकों de नोवो आरएनए बाध्यकारी साइटों की खोज सक्षम, वे इस तरह के श्रम गहन प्रोटोकॉल और महंगी गहरी अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के रूप में कमियों से ग्रस्त हैं और RBP पुल-डाउन के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता हो सकती है. आरएनए की अतिसंवेदनशील प्रकृति के कारण, कई कारक RBP-RNA बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं, सेलुलर संदर्भ में RBP-RNA बाध्यकारी पूछताछ के महत्व पर बल. उदाहरण के लिए, हमने और अन्य ने विवो में आरएनए संरचनाओं और विट्रो10,11में महत्वपूर्ण अंतरों का प्रदर्शन किया है।
एक पिछले अध्ययन12के दृष्टिकोण के आधार पर, हम हाल ही में10 का प्रदर्शन किया है कि जब बैक्टीरियोफेज GA13से capsid RBPs के लिए पूर्व डिजाइन बाध्यकारी साइटों रखने , MS214, PP715, और क्यू में16 एक पत्रकार MRNA के अनुवाद दीक्षा क्षेत्र, रिपोर्टर अभिव्यक्ति दृढ़ता से दमित है. हम एक अपेक्षाकृत सरल और मात्रात्मक विधि प्रस्तुत, इस दमन घटना के आधार पर, RBPs और उनके इसी आरएनए बाध्यकारी साइटके बीच संबंध को मापने के लिए vivo में.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

प्रोटीन अनुवाद की दीक्षा चरण में, राइबोसोम MRNA के दीक्षा क्षेत्र के लिए बांधता है. अनुवाद दीक्षा MRNA के दीक्षा क्षेत्र के लिए एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (RBP) के बंधन द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, जो राइबोसोम बंधन के साथ हस्तक्षेप. प्रस्तुत विधि में, हम इस अवरुद्ध घटना का उपयोग करने के लिए उनके cognate और गैर cognate बाध्यकारी साइटों के लिए RBPs के बाध्यकारी संबंध मात्रा. ऐसा करने के लिए, हम एक पत्रकार MRNA के दीक्षा क्षेत्र में एक परीक्षण बाइंडिंग साइट डालने और परीक्षण RBP की अभिव्यक्ति प्रेरित. RBP-RNA बाइंडिंग के मामले में, हमने रिपोर्टर अभिव्यक्ति के एक सिग्मोइडल दमन को आरबीपी सांद्रता के एक समारोह के रूप में देखा। बाध्यकारी साइट और आरबीपी के बीच कोई आत्मीयता या बहुत कम आत्मीयता के मामले में, कोई महत्वपूर्ण दमन नहीं देखा गया था। विधि लाइव जीवाणु कोशिकाओं में किया जाता है, और महंगी या परिष्कृत मशीनरी की आवश्यकता नहीं है। यह विभिन्न RBPs है कि बैक्टीरिया में काम कर रहे हैं डिजाइन बाध्यकारी साइटों का एक सेट करने के लिए बाध्यकारी सजातीयता के बीच परिमाणीकरण और तुलना के लिए उपयोगी है. इस विधि उच्च संरचनात्मक जटिलता के साथ बाध्यकारी साइटों के लिए अनुपयुक्त हो सकता है. यह आरबीपी के अभाव में जटिल एमआरएनए संरचना द्वारा राइबोसोमल दीक्षा के दमन की संभावना के कारण है, जिसके परिणामस्वरूप कम बेसल रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति होगी, और इस प्रकार आरबीपी बाइंडिंग पर कम-देखने योग्य रिपोर्टर दमन होगा।

प्रस्तुत विधि में एमआरएनए अणु के लिए बाध्य करने के लिए आरबीपी तथा राइबोसोम के बीच प्रतिस्पर्धा का उपयोग किया जाता है (चित्र 1)। यह प्रतियोगिता प्रेरक की बढ़ती सांद्रता के कारण आ?...

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An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

बैक्टीरिया में प्रोटीन-आरएनए बाइंडिंग की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक परख

इस विधि में, हम आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) की बाध्यकारी समानता को एक सरल, लाइव, रिपोर्टर परख का उपयोग करके एक सरल, लाइव, रिपोर्टर परख का उपयोग करने के लिए cognate और गैर-cognate बाध्यकारी साइटों के लिए परिमाणित. परख एक पत्रकार जीन के दमन पर आधारित है.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

वीवो में आरएनए के लिए बाध्यकारी प्रोटीन का लक्षण वर्णन आरएनए की जटिल प्रकृति और प्रोटीन के साथ इसकी बातचीत को प्रभावित करने वाले कई कारकों के कारण एक बड़ी चुनौती बनी हुई है । आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन या आरबीपी-आरएनए आत्मीयता जीवित जीवाणु कोशिकाओं के अंदर मापा जाता है। चूंकि सेलुलर वातावरण आरएनए और परिणामी आरबीपी-आरएनए बाध्यकारी की संरचना दोनों को प्रभावित करता है, इसलिए वीवो में आत्मीयता को मापने के लिए प्राकृतिक प्रणालियों में ऐसी बातचीत को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।सफलता का रहस्य प्लाज्मिड्स के डिजाइन में है। डिजाइन डेल्टा की कई तरंगों का उपयोग करें और बंद codons और फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन के सम्मिलन से बचना चाहिए। बाध्यकारी साइट कैसेट डिजाइन करके इस प्रोटोकॉल शुरू करें।प्रत्येक मिनी जीन में एक EagI प्रतिबंध साइट, Kanamycin प्रतिरोध जीन के पांच प्रमुख अंत से ४० कुर्सियां, pLac/आरा प्रमोटर, राइबोसोम बाध्यकारी साइट, mCherry जीन के अगस्त, एक स्पेसर, एक RBP बाध्यकारी साइट, mCherry जीन के पांच प्रमुख अंत से ८० कुर्सियां, और एक APALI प्रतिबंध साइट शामिल हैं । परख की सफलता दर बढ़ाने के लिए, कम से कम एक, दो और तीन ठिकानों से मिलकर स्पेसर्स के साथ प्रत्येक बाध्यकारी साइट के लिए तीन बाध्यकारी साइट कैसेट डिजाइन करें। डाइजेस्ट के कॉलम शुद्धिकरण करने से पहले ईएजी एचएफ और ApaLI के साथ मिनी जीन और लक्ष्य वेक्टर दोनों को डबल डाइजेस्ट करें।बाध्यकारी साइट रीढ़ की हड्डी के लिए पचा मिनी जीन ligate mCherry रिपोर्टर जीन, टर्मिनेटर और एक kanamycin प्रतिरोध जीन के बाकी युक्त । फिर लिगेशन समाधान को एस्चेरिचिया कोलाई टॉप 10 कोशिकाओं में बदल दें। सेंगर अनुक्रमण के माध्यम से सकारात्मक ट्रांसफॉर्मेंट की पहचान करने के बाद, 96 अच्छी तरह से प्रारूप में शुद्ध प्लाज्मिड को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।इसके अलावा ९६ अच्छी तरह से प्रारूप में ग्लिसरोल स्टॉक के रूप में जीवाणु उपभेदों को शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । कस्टम आदेश आवश्यक RBP अनुक्रम सिरों पर प्रतिबंध साइटों के साथ एक डबल फंसे डीएनए मिनी जीन के रूप में एक बंद codon कमी । तैयार प्लाज्मिड को रासायनिक रूप से सक्षम जीवाणु कोशिकाओं में बदलना जिसमें पहले से ही आरबीपी mCerulean प्लाज्मिड होता है।समय बचाने के लिए, प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लुरिया-बर्टानी आगर युक्त आठ लेन प्लेटों पर एक आठ चैनल पिपेटर का उपयोग कर कोशिकाओं को प्लेट करें । कॉलोनियां 16 घंटे में 37 डिग्री सेल्सियस पर दिखाई दें। प्रत्येक डबल ट्रांसफॉर्मेंट के लिए एक ही कॉलोनी का चयन करें और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 1.5 मिलीलीटर एलबी युक्त 48 अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करें।२५० आरपीएम पर मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे की अवधि में कोशिकाओं को बढ़ाएं । ९६ अच्छी तरह से प्लेटों में शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरोल स्टॉक के रूप में रातोंरात स्टोर करें । सुबह में, रोबोट को 96 अच्छी प्लेटों में अर्ध-पोर माध्यम या एसपीएम के 180 माइक्रोलीटर गर्म करने के लिए प्रोग्राम करें।प्रेरक प्लेट तैयार करने के लिए रोबोट कार्यक्रम। एक साफ 96 अच्छी तरह से थाली में, 95% बीए और 5% पौंड से मिलकर एसपीएम के साथ कुओं को तैयार करें। कुओं की संख्या प्रेरक सांद्रता की वांछित संख्या से मेल खाती है।प्रेरक प्लेट में कुओं में C4-एचएसएल जोड़ें जिसमें उच्चतम प्रेरक एकाग्रता होगी। इसके बाद, रोबोट को शून्य से 218 नैनोमोलर तक 23 कम सांद्रता में उच्चतम एकाग्रता कुओं में से प्रत्येक से मध्यम को क्रमिक रूप से पतला करने के लिए कार्यक्रम करें। प्रत्येक प्रेरक कमजोर पड़ने की मात्रा सभी उपभेदों के लिए पर्याप्त होनी चाहिए।रात भर के उपभेदों को पतला करने के लिए, रोबोट को 48 अच्छी प्लेटों में एसपीएम के 180 माइक्रोलीटर के साथ बैक्टीरिया के 20 माइक्रोलीटर मिलाकर 10 के कारक से पतला करने के लिए प्रोग्राम करें। फिर फ्लोरोसेंट माप के लिए उपयुक्त पहले से तैयार स्ट्रेन प्लेट में पतला समाधान से 20 माइक्रोलीटर लेकर 10 के कारक द्वारा फिर से पतला करें। अब रोबोट अंतिम सांद्रता के अनुसार पतला उपभेदों के साथ ९६ अच्छी तरह से प्लेटों के लिए प्रेरक प्लेट से पतला प्रेरक जोड़ने के लिए कार्यक्रम ।छह घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९६ अच्छी तरह से प्लेटें हिला । उस समय के दौरान, ऑप्टिकल घनत्व या 595 नैनोमीटर पर ओडी के माप के साथ-साथ 100 मिनट में प्लेट रीडर के माध्यम से रीचेरी और मसेरुलियन फ्लोरेसेंस लें। सामान्यीकरण उद्देश्यों के लिए, कोई कोशिकाओं के साथ एसपीएम के विकास को मापने जोड़ा ।यहां दिखाया गया है एक सकारात्मक तनाव के लिए तीन आयामी भूखंड हैं । भूखंड कच्चे ओडी स्तर, mCerulean फ्लोरेसेंस, और समय और प्रेरक एकाग्रता के एक समारोह के रूप में mCherry फ्लोरेसेंस को दर्शाते हैं। सकारात्मक और नकारात्मक दोनों उपभेदों के लिए प्रत्येक प्रेरक एकाग्रता के लिए स्थिर-राज्य अभिव्यक्ति के स्तर की गणना की गई थी।रीचेरी उत्पादन दर भी सकारात्मक और नकारात्मक दोनों उपभेदों के लिए प्रत्येक प्रेरक एकाग्रता के लिए गणना की गई थी। रीचेरी उत्पादन दर को दो उपभेदों के लिए दो जैविक डुप्लिकेट पर औसतन मतलब mCerulean फ्लोरेसेंस के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया गया था। फिटिंग सूत्र का उपयोग कर फिट KRBP सकारात्मक तनाव एक विशिष्ट बाध्यकारी प्रतिक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है ।नकारात्मक तनाव के लिए, कोई केआरबीपी मूल्य निकाला गया था । सामान्यीकृत खुराक प्रतिक्रिया घटता विभिन्न स्थानों पर 10 बाध्यकारी साइटों के रूप में दो RBPs के आधार पर 30 विभिन्न उपभेदों के लिए निर्धारित किया गया। तीन प्रकार की प्रतिक्रियाएं देखी जाती हैं, उच्च आत्मीयता, कम आत्मीयता, और कोई आत्मीयता नहीं।यहां दिखाया गया है दो RBPs, MS2 कोट प्रोटीन और PP7 कोट प्रोटीन के लिए मात्रात्मक KRBP परिणाम 10 अलग बाध्यकारी साइट कैसेट के साथ कर रहे हैं । चार अलग-अलग स्थानों पर एक उत्परिवर्ती बाध्यकारी साइट के साथ MS2 कोट प्रोटीन के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता यहां दिखाया गया है ताकि रीचेरी उत्पादन पर उत्परिवर्ती अंतर के प्रभाव को प्रदर्शित किया जा सके। परीक्षण उत्परिवर्तित बाध्यकारी साइट का अनुक्रम दिखाया गया है।प्रोटीन-आरएनए परिसर की संरचना की रासायनिक जांच करने और यह कल्पना करना महत्वपूर्ण है कि कौन से एमआरएनए क्षेत्र आरएनए बाइंडिंग से प्रभावित हैं। हाल ही में, हमने इस तकनीक का उपयोग उच्च थ्रूपुट तरीके से किया ताकि आरबीपीएस की आत्मीयता को 10, 000 बाध्यकारी साइटों तक एक साथ मापा जा सके।

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

मरीज के ऊतकों के लिए मिथाइल बाध्यकारी डीएनए अनुक्रमण कब्जा

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

सूक्ष्मजीवों के अनुकूली प्रयोगशाला विकास के लिए प्रक्रिया एक Chemostat का प्रयोग

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

उपन्यास आरएनए बंधनकारी प्रोटीन अलगाव तेजी पद्धति द्वारा

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

शारीरिक ऑक्सीजन स्थिति से अवगत कराया मानव कोशिकाओं में कैप बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

क्रोमेटिन को संशोधित करने के थोक क्रोमेटिन बाइंडिंग गुणों के विश्लेषण के लिए अनुक्रमिक नमक निकालने के परिसरों

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

पेट में रंजकता को बढ़ाते हुए<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

इन विट्रो Bioluminescence परख स्तन उपकला कोशिकाओं में Circadian ताल की विशेषता के लिए

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

वास्तविक समय प्रतिलेखन कारक बंधन, प्रतिलेखन, अनुवाद, और कारोबार सेलुलर सक्रियण के दौरान वैश्विक घटनाओं को प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

बैक्टीरिया पर चयन और विकास के आधार पर Dictyostelium discoideum कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

विनियामक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन ्स्स्स के लिए बाइंडिंग साइट्स की पहचान करने के लिए अनुक्रम स्थान की खोज

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...