Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
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このプロジェクトは、計画予算委員会のI-COREプログラムとイスラエル科学財団(助成金第152/11)、マリー・キュリー再統合助成金第1号から資金を受け取りました。PCIG11-GA- 2012-321675、および補助金契約第664918号の下で欧州連合のホライズン2020研究革新プログラムから - MRG-文法。

1. システムの準備
<ol><li>結合部位プラスミドの設計
	<ol>
<li>図 1に示すように、バインディング サイト カセットを設計します。各ミニ遺伝子は、以下の部分(5'〜3'):Eagl制限部位、カナマイシン(Kan)耐性遺伝子の5'末端の40塩基、pLac-Araプロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー(δ)、RBP結合部位、5'末端の80塩基を含むmCherry遺伝子?...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

本稿に記載の方法は、大腸菌細胞におけるRBP-RNA結合親和性の生体内測定を容易にする。プロトコルは比較的簡単で、高度な機械を使用せずに行うことができ、データ分析は簡単です。さらに、結果は、次世代シーケンシング(NGS)結果に関連する比較的長い待ち時間なしで、すぐに生成されます。
この方法の 1 つの制限は、細菌細胞でのみ動作することです。.しか?...

RNA結合タンパク質(RBP)ベースの転写後調節、特にRBPとRNAとの相互作用の特徴付けは、ここ数十年で広範囲に研究されている。RbP阻害に起因する細菌における翻訳下調節の複数の例があり、または直接競合する、リボソーム結合1、2、3。合成生物学の分野では、RBP-RNA相互作用は転写ベースの遺伝回路4、5の設計のための重要なツールとして出現している。従って、このようなRBP-RNA相互作用の特性化に対する需要が細胞コンテキスト内で増加している。
タンパク質-RNA相互作用を研究するための最も一般的な方法は、インビトロ設定に限定される電気泳動シフトアッセイ(EMSA)6、およびCLIP法8、9を含む様々なプルダウンアッセイ7である。.このような方法は、デノボRNA結合部位の発見を可能にする一方で、労働集約的なプロトコルや高価な深いシーケンシング反応などの欠点に苦しんでおり、RBPプルダウンに対する特定の抗体を必要とする場合があります。RNAがその環境に対して感受性を持つため、多くの因子がRBP-RNA相互作用に影響を与える可能性があり、細胞コンテキストにおけるRBP-RNA結合を調知することの重要性を強調する。例えば、我々と他の人は、インビボとインビトロ10、11におけるRNA構造の間に有意な差を示した。
以前の研究12のアプローチに基づいて、我々は最近、バクテリオファージGA 13、MS214、PP715、およびQβ16からカプシドRBP用に事前に設計された結合部位を配置する際に10を実証した。レポーターmRNAの翻訳開始領域は、レポーター表現が強く抑圧されている。この抑圧現象に基づいて比較的単純で定量的な方法を提示し、生体内のRBPと対応するRNA結合部位との間の親和性を測定する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

タンパク質翻訳の開始ステップでは、リボソームはmRNAの開始領域に結合する。翻訳開始は、リボソーム結合を妨げるmRNAの開始領域へのRNA結合タンパク質(RBP)の結合によって遮断されうる。提示された方法では、このブロッキング現象を利用して、その認知部位および非認知結合部位に対するRBPの結合親和性を定量化する。これを行うには、レポーターmRNAの開始領域に試験結合部位を挿入し、試験RBPの発現を誘導する。RBP-RNA結合の場合、RBP濃度の関数としてレポーター発現のシグモイド式の抑圧を観察した。結合部位とRBPとの間に親和性がないか、または非常に低い親和性の場合、有意な抑圧は認められなかった。この方法は、生きた細菌細胞で行われ、高価な機械や洗練された機械を必要としません。これは、細菌で機能する異なるBRBの結合親和性を、設計された結合部位のセットと定量化し、比較するのに有用である。この方法は、構造の複雑度が高い部位をバインドする場合には不適切な場合があります。これは、RBPが存在しない場合に複雑なmRNA構造によるリボソーム開始の抑圧の可能性に起因し、これは基底レポーター遺伝子発現を低下させ、したがってRBP結合時に観察可能なレポーターの抑圧をもたらす。

提示された方法は、mRNA分子に結合するためのRBPとリボソームとの間の競争を利用する(図1)。この競争は、インデューサーの濃度の増加に起因するRBP-mCeruleanの生産増加の関数としてmCherryレベルを減少させることによって反映されます。mCerulean蛍光を増加させる場合、mCherryに有意な変化はなく、RBP結合の欠如が推測される。正と負のひずみの両方...

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An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

この方法では、細菌細胞における簡潔な生きたレポーターアッセイを用いて、RNA結合タンパク質(RBP)の結合親和性を、簡潔で生きたレポーターアッセイを用いて認知および非認知結合部位に定量する。アッセイはレポーター遺伝子の抑圧に基づいています。

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

RNAの複雑な性質とタンパク質との相互作用に影響を与える多くの要因により、生体内でのRNAに結合するタンパク質の特性評価は依然として大きな課題です。RNA結合タンパク質またはRBP-RNAアフィニティーは、生きた細菌細胞の内部で測定される。細胞環境はRNAとRBP-RNA結合の両方の構造に影響を与えるので、生体内の親和性を測定することは、自然界におけるそのような相互作用を理解するために重要です。成功の秘訣はプラスミドのデザインにある。設計はデルタのいくつかの波を使用し、停止コドンおよびフレームシフト突然変異の挿入を避けるべきである。バインド サイト カセットを設計して、このプロトコルを開始します。各ミニ遺伝子には、EagI制限部位、カナマイシン耐性遺伝子の5つの素端から40塩基、pLac/Araプロモーター、リボソーム結合部位、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー、RBP結合部位、mCherry遺伝子の5つの素端から80塩基、およびApaLI制限部位が含まれている。アッセイの成功率を高めるために、少なくとも1つ、2つおよび3つの塩基からなるスペーサーを備えた結合部位ごとに3つの結合部位カセットを設計する。小遺伝子と標的ベクターの両方をEagI HFおよびApaLIで二重消化してから、消化器のカラム精製を行う。消化したミニ遺伝子を、mCherryレポーター遺伝子の残りの部分、ターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含む結合部位バックボーンにリゲートする。次に、ライゲーション溶液を、大腸菌トップ10細胞に変換する。サンガーシーケンシングを介して正の形質転換体を同定した後、精製プラスミドをマイナス20°Cで96ウェル形式で保存します。また、マイナス80°Cで96ウェル形式でグリセロールストックとして細菌株を保存します。エンドに制限部位を有する二本鎖DNAミニ遺伝子としてストップコドンを欠いた必要なRBP配列をカスタムオーダーする。調製したプラスミドを、RBP mCeruleanプラスミドを既に含む化学的に有能な細菌細胞に変換します。時間を節約するために、関連する抗生物質とルリア・ベルタニ寒天を含む8レーンプレートに8チャネルピペッタを使用して細胞をプレートします。コロニーは摂氏37度で16時間で表示する必要があります。各二重変性剤のための単一のコロニーを選択し、適切な抗生物質とLBの1.5ミリリットルを含む48ウェルプレートに移す。250 RPMで摂氏37度で18時間の期間にわたって細胞を成長させます。96ウェルプレートでマイナス80°Cのグリセロール在庫として一晩保存します。午前中には、96ウェルプレートで180マイクロリットルの半細孔媒体またはSPMを暖かくするようにロボットをプログラムします。インデューサープレートを準備するロボットをプログラムします。きれいな96の井戸の版で、95%BAおよび5%LBから成るSPMと井戸を準備する。ウェルの数は、誘導体濃度の所望の数に対応します。最高のインデューサー濃度を含むインデューサプレートのウェルにC4-HSLを加えます。次に、最高濃度の井戸のそれぞれから、ゼロから218ナノモルまでの23の低濃度に培地を連続的に希釈するようにロボットをプログラムします。各誘導体希釈の体積は、すべての株に対して十分であるべきである。一晩の株を希釈するには、48ウェルプレートに180マイクロリットルのSPMと20マイクロリットルの細菌を混合することによって、ロボットを10倍に希釈するようにプログラムします。次に、希釈溶液から20マイクロリットルを蛍光測定に適した事前調製された歪みプレートに取り込んで、10の倍率で再び希釈する。次に、最終的な濃度に応じて希釈された歪みで、インデューサプレートから96ウェルプレートに希釈されたインデューサーを追加するようにロボットをプログラムします。摂氏37度で96のウェルプレートを6時間振ります。その間、595ナノメートルの光学密度またはODの測定を行い、30分ごとにプレートリーダーを介してmCherryとmCerulean蛍光を測定します。正規化のために、細胞を加えたものなしでSPMの成長を測定する。ここに示されているのは、正の歪みの3次元プロットです。プロットは、時間および誘導体濃度の関数として生のODレベル、mCerulean蛍光、およびmCherry蛍光を描いている。mCerulean定常式レベルは、正および負の両方の株に対する各誘導体濃度について計算した。mCherryの生産速度は、正と負の両方の株の各誘導体濃度についても計算した。mCherryの生産速度は、2株に対して2つの生物学的重複を平均した平均mCerulean蛍光の関数としてプロットした。フィッティング式を用いたフィットKRBPは、特定の結合応答を示す正のひずみについて示される。負のひずみについては、KRBP値は抽出されなかった。正規化された用量応答曲線は、異なる場所で10の結合部位として2つのRMPに基づいて30の異なる株について決定した。3種類の応答が観察され、高い親和性、低親和性、および親和性がない。ここに示されているのは、2つのRBP、MS2コートタンパク質およびPP7コートタンパク質と10の異なる結合部位カセットの定量的KRBP結果である。4つの異なる場所で変異結合部位を有するMS2コートタンパク質の用量応答曲線は、mCherry産生に対する変異間隔の影響を示すためにここに示されている。テストされた変異結合部位のシーケンスが表示されます。タンパク質RNA複合体の構造を化学的にプローブし、RNA結合によって影響を受けるmRNA領域を可視化するために、形状シークなどの構造技術を使用することが重要です。最近、この手法を高スループット方式で使用して、RPSの結合部位を10,000個に同時に測定しました。

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

遺伝学

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

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腹部色素沈着の定量化<em&gt;ショウジョウバエmelanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

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体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ

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Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

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Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

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キイロタマホコリカビの選択に基づいて細胞と細菌の成長の遺伝子工学

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Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...