Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
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이 프로젝트는 기획 및 예산 위원회의 I-CORE 프로그램과 이스라엘 과학 재단 (그랜트 번호 152/11), 마리 퀴리 재통합 보조금 번호에서 자금을 받았다. PCIG11-GA- 2012-321675, 및 보조금 계약 번호 664918에 따라 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 - MRG-문법.

1. 시스템 준비
<ol><li>바인딩 사이트 플라스미드 설계
	<ol>
<li>그림1에 설명된 대로 바인딩 사이트 카세트를 디자인합니다. 각 미니유전자는 다음과 같은 부분(5' ~ 3')을 포함하며, Eagl 제한 부위, +40 기저의 카나마이신(Kan) 저항 유전자, pLac-Ara 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), mCherry 유전자의 AUG, 스페이서(δ), RBP 결합 부위, 5' 말단의 80염기 mCherry 유전자, 및 ApaLI ?...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

본 항에 기술된 방법은 대장균 세포에서 RBP-RNA 결합 친화도의 생체 내 정량적 측정을 용이하게 한다. 이 프로토콜은 비교적 쉽고 정교한 기계를 사용하지 않고도 수행될 수 있으며 데이터 분석은 간단합니다. 더욱이, 결과는 차세대 염기서열 분석(NGS) 결과와 관련된 비교적 긴 대기 시간 없이 즉시 생성된다.
이 방법의 한 가지 제한은 세균 세포에서만 작동한다는 것입?...

RNA 결합 단백질(RBP)-기반 전사 후 조절, 특히 RBPs와 RNA 사이의 상호작용의 특성화는 최근 수십 년 동안 광범위하게 연구되고 있다. RBPs 억제에서 유래 하는 박테리아에서 번역 다운 조절의 여러 예가 있다, 또는직접 경쟁, 리보솜 바인딩 1,2,3. 합성 생물학 분야에서, RBP-RNA 상호 작용은 전사 기반 유전 회로4,5의설계를위한 중요한 도구로 부상하고 있다. 따라서, 세포 문맥에서 이러한 RBP-RNA 상호작용의 특성화에 대한 수요가 증가하고 있다.
단백질 RNA 상호 작용을 연구하기 위한 가장 일반적인 방법은 시험관내 설정으로 제한되는 전기동이동성 시프트 분석법(EMSA)6,및 CLIP 방법8,9를 포함한 다양한 풀다운 분석7이다. . 이러한 방법은 de novo RNA 결합 부위의 발견을 가능하게 하는 동안, 그들은 노동 집약적인 프로토콜 및 비싼 깊은 시퀀싱 반응과 같은 결점 때문에 손해를 입고 RBP 풀다운을 위한 특정 항체를 요구할 수 있습니다. 그것의 환경에 RNA의 영향을 받기 쉬운 특성 때문에, 많은 요인은 세포 문맥에서 RBP-RNA 결합을 심문하는 의 중요성을 강조하는 RBP-RNA 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 우리 및 그 외는 생체내 RNA 구조와 체외10,11사이의 유의한 차이를 입증하였다.
이전 연구12의접근법에 기초하여, 우리는 최근에 박테리오파지 GA13,MS214,PP715및 Qβ16에서 캡시드 RBP에 대한 미리 설계된 결합 부위를 배치할 때 10을 입증했다. [mRNA] 기자의 번역 개시 부위, 리포터 표현이 강하게 억압된다. 우리는 이 억압 현상에 근거하여, RBP와 그들의 대응하는 RNA 결합부위의 생체 내 친화성을 측정하기 위해 비교적 간단하고 정량적인 방법을 제시한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

단백질 번역의 개시 단계에서, 리보솜은 mRNA의 개시 부위에 결합한다. 번역 개시는 리보솜 결합을 방해하는 mRNA의 개시 지구에 RNA 결합 단백질 (RBP)의 결합에 의해 차단될 수 있습니다. 제시된 방법에서는, 우리는 그들의 동체 및 비 cognate 결합 사이트에 대한 RP의 결합 친화도를 정량화하기 위해 이 차단 현상을 이용한다. 이를 위해, 우리는 리포터 mRNA의 개시 부위에 시험 결합 부위를 삽입하고 시험 RBP의 발현을 유도한다. RBP-RNA 결합의 경우, 우리는 RBP 농도의 함수로서 리포터 발현의 시그노이드 억압을 관찰했다. 결합 부위와 RBP 사이의 친화성 또는 매우 낮은 친화력의 경우, 유의한 억압이 관찰되지 않았다. 이 방법은 살아있는 세균 세포에서 수행되며 비싸거나 정교한 기계가 필요하지 않습니다. 박테리아에서 기능하는 상이한 RP의 결합 친화도를 설계된 결합 부위세트에 정량화하고 비교하는 데 유용합니다. 이 방법은 구조적 복잡성이 높은 사이트를 바인딩하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 이는 RBP가 없는 복잡한 mRNA 구조에 의한 리보좀 개시의 억제 가능성, 이는 낮은 기저 리포터 유전자 발현을 초래할 것이고, 따라서 RBP 결합에 대한 관찰력이 떨어지는 리포터 억압에 기인한다.

제시된 방법은 mRNA 분자에 결합하기 위한 RBP와 리보솜사이의 경쟁을 이용한다(도 1). 이 경쟁은 유도제의 농도 증가로 인해 RBP-mCerulean의 증가 생산의 함수로 mCherry 수준을 감소시킴으로써 반영됩니다. mCherry에 큰 변화가 없는 mCerulean 형광이 증가하는 경우, RBP 결합의 부족은 추론된다. 양수 및 음의 변형모두에 대한 대표적인 결과는 그...

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An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

이 방법에서, 우리는 세균 세포에서 단순, 살아있는, 리포터 분석법을 사용하여 동축 및 비동종 결합 부위에 RNA 결합 단백질(RBPs)의 결합 친화도를 정량화한다. 분석은 기자 유전자의 억압에 근거를 둔다.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

생체 내 RNA에 결합하는 단백질의 특성화는 RNA의 복잡한 특성과 단백질과의 상호 작용에 영향을 미치는 많은 요인으로 인해 주요 과제로 남아 있습니다. RNA 결합 단백질 또는 RBP-RNA 친화성은 살아있는 세균 세포 내부에서 측정된다. 세포 환경은 RNA와 결과 RBP-RNA 결합의 구조 모두에 영향을 미치기 때문에 생체 내의 친화성을 측정하는 것은 자연 시스템에서 이러한 상호 작용을 이해하는 데 매우 중요합니다.성공의 비결은 플라스미드의 디자인입니다. 디자인은 델타의 여러 파도를 사용하고 정지 코돈과 프레임 시프트 돌연변이의 삽입을 피해야한다. 바인딩 사이트 카세트를 디자인하여 이 프로토콜을 시작합니다.각 미니 유전자에는 EagI 제한 부위, 카나마이신 저항 유전자의 5개의 프라임 엔드로부터 40개의 염기, pLac/Ara 프로모터, 리보솜 결합 부위, 8월 mCherry 유전자, 스페이서, RBP 결합 부위, mCherry 유전자의 5개의 최종로부터 80개의 염기, 및 ApaLI 제한 부위가 포함되어 있다. 분석의 성공률을 높이기 위해 각 바인딩 부위에 대해 최소 1개, 2개 및 3개의 베이스로 구성된 스페이서에 대해 3개의 바인딩 사이트 카세트를 설계합니다. 다이제스트의 컬럼 정화를 수행하기 전에 EagI HF 및 아파리를 통해 미니 유전자와 표적 벡터를 모두 이중 소화한다.mCherry 리포터 유전자, 종기 및 가나마이신 저항 유전자의 나머지 부분을 포함하는 결합 부위 백본에 소화된 미니 유전자를 리게이트합니다. 그런 다음 결찰 용액을 대장균 상위 10개 세포로 변환합니다. Sanger 시퀀싱을 통해 양성 변혁제를 식별한 후 96°C의 정제된 플라스미드를 영하 20도의 우물 형식으로 보관하십시오.또한 혈당 육로 주식으로 세균 균주를 저장 96 영하 80도에서 잘 형식. 사용자 정의 순서는 끝에 제한 사이트가있는 이중 좌초 DNA 미니 유전자로 정지 코돈이 부족한 필요한 RBP 서열을 한다. 준비된 플라스미드를 이미 RBP mCerulean 플라스미드를 함유한 화학적으로 유능한 세균 세포로 변환합니다.시간을 절약하기 위해, 관련 항생제와 Luria-Bertani 천을 포함하는 8 개의 레인 플레이트에 8 채널 파이프터를 사용하여 세포를 판화. 식민지는 섭씨 37도에서 16 시간 동안 나타나야합니다. 각 이중 변압제에 대한 단일 콜로니를 선택하고 적절한 항생제로 LB1.5 밀리리터를 포함하는 48 개의 웰 플레이트로 옮길 수 있습니다.250 RPM에서 흔들리는 섭씨 37도에서 18 시간 동안 세포를 성장시면 됩니다. 글리세롤 주식으로 하룻밤을 저장 영하 80 도 96 잘 접시에 섭씨. 아침에는 로봇을 프로그래밍하여 96개의 웰 플레이트에서 반모공 배지 또는 SPM 의 180 마이크로리터를 따뜻하게 합니다.유도플레이트를 준비하도록 로봇을 프로그래밍한다. 깨끗한 96 웰 플레이트에서 95 %의 BA와 5 %의 LB로 구성된 SPM으로 우물을 준비하십시오. 우물의 수는 유도제 농도의 원하는 수에 해당한다.유도체 농도가 가장 높은 유도체 플레이트의 우물에 C4-HSL을 추가합니다. 다음으로, 로봇을 프로그래밍하여 각 고농도 우물에서 0에서 218 나노몰러까지 23개의 낮은 농도로 배지를 연속적으로 희석시 한다. 각 유도제 희석의 부피는 모든 균주에 충분해야 합니다.하룻밤 균주를 희석하기 위해 로봇을 48 웰 플레이트에 SPM 180 마이크로리터와 박테리아 20 마이크로리터를 혼합하여 10배의 배분으로 희석하도록 프로그래밍합니다. 그런 다음 희석된 용액에서 20마이크로리터를 형광 측정에 적합한 미리 준비된 균질 플레이트로 복용하여 10배의 계수로 다시 희석한다. 이제 로봇을 프로그래밍하여 최종 농도에 따라 희석된 균주와 함께 유도판으로부터 96웰 플레이트에 희석유도자를 첨가한다.6시간 동안 섭씨 37도에서 96개의 우물판을 흔들어 보냅니다. 이 기간 동안, 30분마다 플레이트 리더기를 통해 595 나노미터의 광학 밀도 또는 OD뿐만 아니라 mCherry 및 mCerulean 형광을 측정하십시오. 정규화를 위해 셀이 첨가되지 않은 SPM의 성장을 측정합니다.여기에 는 양수 변형에 대한 3차원 플롯이 표시됩니다. 플롯은 원시 OD 수준, mCerulean 형광 및 mCherry 형광을 시간 및 유도기 농도의 함수로 묘사합니다. mCerulean 정상 상태 발현 수준은 양수 및 음수 균주 모두에 대한 각 유도체 농도에 대해 계산되었다.mCherry 생산 속도는 또한 양수 및 음수 균주 모두에 대한 각 유도기 농도에 대해 계산되었다. mCherry 생산 속도는 두 개의 균주에 대한 두 개의 생물학적 중복을 통해 평균 평균 평균 mCerulean 형광의 함수로 플롯되었다. 피팅 공식을 사용하는 적합 KRBP는 특정 결합 반응을 나타내는 양성 균주에 대해 도시된다.음수 변형의 경우 KRBP 값이 추출되지 않았습니다. 정규화된 투여량 반응 곡선은 서로 다른 위치에서 10개의 결합 부위로서 2개의 RBP를 기반으로 30개의 다른 균주에 대해 결정되었다. 세 가지 유형의 응답이 관찰되고, 선호도가 높고, 선호도가 낮으며, 친화력이 없습니다.여기에 표시된 2개의 RBPs를 위한 정량적인 KRBP 결과, MS2 코트 단백질 및 10개의 상이한 결합 사이트 카세트를 가진 PP7 코트 단백질. 4개의 다른 위치에서 돌연변이 결합 부위를 가진 MS2 코트 단백질에 대한 투여량 반응 곡선은 mCherry 생산에 대한 돌연변이 간격의 효과를 보여주기 위해 여기에 도시된다. 테스트된 돌연변이 바인딩 사이트의 시퀀스가 표시됩니다.단백질-RNA 복합체의 구조를 화학적으로 조사하고 RNA 결합에 의해 영향을받는 mRNA 영역을 시각화하고자 하는 모양과 같은 구조 적 기술을 사용하는 것이 중요하다. 최근에는 이 기술을 높은 처리량 방식으로 사용하여 RBP의 선호도를 동시에 10, 000 바인딩 사이트로 측정했습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

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복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

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생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

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Dictyostelium discoideum 셀 선택에 따라 성장과 박테리아에서의 유전 공학

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...