Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

Dette prosjektet fikk støtte fra i-CORE program av planlegging og budsjettering komiteen og Israel Science Foundation (Grant no. 152/11), Marie Curie reintegrasjon Grant no. PCIG11-GA-2012-321675, og fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation program under innvilge avtale no. 664918-MRG-grammatikk.

1. system forberedelse
<ol><li>Design av binding-site plasmider
	<ol>
<li>Utform bindings område kassetten som vist i figur 1. Hver minigene inneholder følgende deler (5 ' til 3 '): Eagl restriksjons område, ∼ 40 baser av 5 ' slutten av kanamycin (kan) motstands genet, pLac-Ara promoter, ribosom bindings sted (RBS), AUG av mCherry genet, en spacer (δ), en RBP bindende område, 80 baser av 5 ' end av mCherry genet, og en ApaLI restriksjon nettsted. Merk:</s...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

Metoden beskrevet i denne artikkelen forenkler kvantitativ in vivo måling av RBP-RNA bindende affinitet i E. coli celler. Protokollen er relativt enkel og kan gjennomføres uten bruk av sofistikerte maskiner, og dataanalyse er grei. Videre er resultatene produseres umiddelbart, uten den relativt lange ventetiden knyttet til neste generasjons sekvensering (NGS) resultater.
En begrensning til denne metoden er at det fungerer bare i bakterielle celler. En tidligere studie<sup class="xre...

RNA bindende protein (RBP)-basert post-transcriptional regulering, spesielt karakterisering av samspillet mellom RBPs og RNA, har blitt studert grundig de siste ti årene. Det finnes flere eksempler på translational ned-regulering i bakterier som stammer fra RBPs hemme, eller direkte konkurrerer med, ribosom binding1,2,3. Innen syntetisk biologi, RBP-RNA interaksjoner fremstår som et betydelig verktøy for utforming av transkripsjon-baserte genetiske kretser4,5. Derfor er det en økning i etterspørselen etter karakterisering av slike RBP-RNA interaksjoner i en cellulær sammenheng.
De vanligste metodene for å studere protein-RNA interaksjoner er Elektroforetiske Mobility Shift-analysen (EMSA)6, som er begrenset til in vitro-innstillinger, og ulike trekk ned analyser7, inkludert klipp metoden8,9 . Selv om slike metoder muliggjør oppdagelsen av de Novo RNA bindings stedene, lider de av ulemper som arbeidsintensive protokoller og dyre reaksjoner i dyp sekvensering, og kan kreve et spesifikt antistoff for RBP-pull-Down. På grunn av den mottakelige karakteren av RNA til sitt miljø, kan mange faktorer påvirke RBP-RNA-interaksjoner, med vekt på viktigheten av forhører RBP-RNA-binding i den cellulære konteksten. For eksempel har vi og andre demonstrert betydelige forskjeller mellom RNA-strukturene i vivo og in vitro10,11.
Basert på tilnærmingen til en tidligere studie12, har vi nylig demonstrert10 at når du plasserer pre-designede bindings steder for KAPSID RBPs fra bacteriophages ga13, MS214, PP715, og Qβ16 i Oversettelses initiering regionen av en reporter mRNA, er reporter uttrykk sterkt undertrykt. Vi presenterer en relativt enkel og kvantitativ metode, basert på dette undertrykkelse fenomenet, for å måle affinitet mellom RBPs og deres tilsvarende RNA bindings steds in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

I initiering trinn av protein oversettelse, ribosom binder seg til initiering regionen av mRNA. Oversettelse initiering kan blokkeres ved binding av en RNA bindende protein (RBP) til initiering regionen av mRNA, som forstyrrer ribosom binding. I den presenterte metoden bruker vi dette blokkerende fenomenet for å kvantifisere bindings affinitet fra RBPs til deres beslektet og ikke-beslektet bindings områder. For å gjøre dette setter vi inn et test bindings område i startområdet for en reporter mRNA og induserer uttrykket av testen RBP. Når det gjelder RBP-RNA-binding, observerte vi en sigmoidal undertrykkelse av reporter uttrykket som en funksjon av RBP-konsentrasjon. Ved manglende affinitet eller svært lav affinitet mellom bindings stedet og RBP, ble det ikke observert signifikant undertrykkelse. Metoden er utført i levende bakterieceller, og krever ikke dyre eller sofistikerte maskiner. Det er nyttig for kvantifisere og sammenligne mellom bindende slektskap av ulike RBPs som er funksjonelle i bakterier til et sett av designet bindende nettsteder. Denne metoden kan være upassende for bindende områder med høy strukturell kompleksitet. Dette skyldes muligheten for undertrykkelse av ribosomal initiering av komplekse mRNA struktur i fravær av RBP, noe som vil resultere i lavere basal reporter genuttrykk, og dermed mindre Observer reporter undertrykkelse på RBP bindende.

Den presenterte metoden utnytter konkurransen mellom en RBP og ribosom for binding til mRNA molekylet (figur 1). Denne konkurransen gjenspeiles ved å redusere mCherry nivåer som en funksjon av økt produksjon av RBP-mCerulean, på grunn av økende konsentrasjoner av induser. I tilfelle av økende mCerulean fluorescens, uten vesentlige endringer i mCherry, en mangel på RBP binding er utledet. Representative resultater for både positiv og negativ belastning...

Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse for kvantifisere protein-RNA binding i bakterier

I denne metoden, kvantifisere vi bindende affinitet av RNA bindende proteiner (RBPs) til beslektet og ikke-beslektet bindende områder ved hjelp av en enkel, Live, reporter analysen i bakterielle celler. Analysen er basert på undertrykkelse av et reporter gen.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Karakterisering av proteinbinding til RNA in vivo er fortsatt en stor utfordring på grunn av RNAs komplekse natur og de mange faktorene som påvirker samspillet med proteiner. RNA bindende protein eller RBP-RNA affinitet måles inne i levende bakterielle celler. Siden cellulært miljø påvirker både strukturen til RNA og resulterende RBP-RNA binding, er måling av affiniteten in vivo avgjørende for å forstå slike interaksjoner i naturlige systemer.Hemmeligheten til suksess er i utformingen av plasmids. Utformingen bør bruke flere bølger av delta og unngå innsetting av stop codons og frameshift mutasjoner. Start denne protokollen ved å utforme bindingsområdekassetten.Hvert minigen inneholder et EagI-restriksjonssted, 40 baser fra den fem viktigste enden av kanamycinresistensgenet, pLac / Ara-arrangøren, ribosombindingsstedet, AUG av mCherry-genet, en avstandsr, et RBP bindende sted, 80 baser fra den fem viktigste enden av mCherry-genet og et ApaLI-restriksjonssted. For å øke suksessraten for analysen, design tre bindende stedskassetter for hvert bindingsområde med avstandssytter bestående av minst en, to og tre baser. Dobbel fordøye både mini gener og målet vektor med EagI HF og ApaLI før du utfører kolonne rensing av sammendrag.Ligate de fordøyde minigenene til bindingsstedets ryggrad som inneholder resten av mCherry-reportergenet, terminatoren og et kanamycinresistensgen. Deretter forvandler ligation løsningen til Escherichia coli topp 10 celler. Etter å ha identifisert positive transformanter via Sanger sekvensering, lagre renset plasmids i 96 brønnformat på minus 20 grader Celsius.Lagre også bakteriestammene som glyserollagre i 96-brønnformatet ved minus 80 grader Celsius. Tilpasset rekkefølge den nødvendige RBP-sekvensen mangler en stoppkodon som et dobbelttrådet DNA minigen med restriksjonssteder i endene. Forvandle de tilberedte plasmidene til kjemisk kompetente bakterielle celler som allerede inneholder en RBP mCerulean plasmid.For å spare tid, plate cellene ved hjelp av en åtte kanal pipetter på åtte lane plater som inneholder Luria-Bertani agar med relevante antibiotika. Kolonier skal vises om 16 timer ved 37 grader Celsius. Velg en enkelt koloni for hver dobbel transformant og overfør til 48 brønnplater som inneholder 1,5 milliliter LB med passende antibiotika.Vokse cellene over en periode på 18 timer ved 37 grader Celsius risting ved 250 RPM. Lagre overnattinger som glyserol aksjer på minus 80 grader Celsius i 96 brønnplater. Om morgenen kan du programmere roboten til å varme 180 mikroliter semi-pore medium eller SPM i 96 brønnplater.Programmer roboten til å klargjøre induktorplaten. I en ren 96 brønnplate, forberede brønner med SPM bestående av 95% BA og 5% LB. Antall brønner tilsvarer ønsket antall induktorkonsentrasjoner.Tilsett C4-HSL i brønnene i induktorplaten som inneholder den høyeste induktorkonsentrasjonen. Deretter programmerer du roboten til serielt fortynnet medium fra hver av de høyeste konsentrasjonsbrønnene til 23 lavere konsentrasjoner fra null til 218 nanomær. Volumet av hver induktor fortynning bør være tilstrekkelig for alle stammer.For å fortynne de nattlige stammene, programmer roboten til å fortynne med en faktor på 10 ved å blande 20 mikroliter bakterier med 180 mikroliter SPM i 48 brønnplater. Deretter fortynnes igjen med en faktor på 10 ved å ta 20 mikroliter fra den fortynnede oppløsningen inn i den forhåndsberedte stammeplaten egnet for fluorescerende måling. Programmer roboten til å tilsette den fortynnede induktoren fra induktorplaten til de 96 brønnplatene med fortynnede stammer i henhold til de endelige konsentrasjonene.Rist 96 brønnplatene ved 37 grader Celsius i seks timer. I løpet av den tiden, ta målinger av optisk tetthet eller OD på 595 nanometer samt mCherry og mCerulean fluorescens via en plateleser hvert 30. For normaliseringsformål, måle veksten av SPM uten celler lagt til.Vist her er tredimensjonale tomter for en positiv belastning. Plottene viser rå OD-nivåer, mCerulean fluorescens og mCherry fluorescens som en funksjon av tid og induktor konsentrasjon. mCerulean steady-state uttrykksnivåer ble beregnet for hver induktorkonsentrasjon for både de positive og negative stammene.MCherry-produksjonshastigheten ble også beregnet for hver induktorkonsentrasjon for både positive og negative stammer. mCherry produksjonshastighet ble plottet som en funksjon av gjennomsnittlig mCerulean fluorescens gjennomsnitt over to biologiske duplikater for to stammer. Passformen KRBP ved hjelp av tilpasningsformelen vises for den positive belastningen som viser en bestemt bindingsrespons.For den negative belastningen ble ingen KRBP-verdi hentet ut. Normaliserte doseresponskurver ble bestemt for 30 forskjellige stammer basert på to RBPer som 10 bindingssteder på forskjellige steder. Tre typer svar observeres, høy affinitet, lav affinitet og ingen affinitet.Vist her er kvantitative KRBP resultater for to RBPs, MS2 pels protein og PP7 pels protein med 10 forskjellige bindende området kassetter. Doseresponskurver for MS2-strøkprotein med et mutert bindingssted på fire forskjellige steder er vist her for å demonstrere effekten av mutantavstanden på mCherry-produksjonen. Sekvensen av det testede muterte bindingsstedet vises.Det er viktig å bruke en strukturell teknikk som form søker å kjemisk undersøke strukturen av protein-RNA kompleks og å visualisere hvilke mRNA-regioner som påvirkes av RNA binding. Nylig brukte vi denne teknikken på en høy gjennomstrømning måte for å samtidig måle affiniteten til RBPs til 10.000 bindende nettsteder.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-binding DNA-fangst Sekvense for Pasientservietter

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Prosedyre for Adaptive Laboratory Utviklingen av mikroorganismer ved hjelp av en kjemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel RNA-bindende proteiner Isolering av den raske Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse av Cap-bindende proteiner i humane celler eksponert for Fysiologiske oksygenforholdene

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sekvensiell Salt utdrag for analyse av Bulk Chromatin bindende egenskaper Chromatin endre komplekser

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantifiserende abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescens analysen som karakteriserer døgnrytmen i Mammary epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknologi Dictyostelium discoideum cellene basert på valget og vekst på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Utforske sekvens plass til å identifisere bindende områder for regulatoriske RNA-binding proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...