Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
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Este projeto recebeu financiamento do programa I-CORE do Comitê de planejamento e orçamento e da Fundação de ciência de Israel (Grant no. 152/11), Marie Curie reintegration Grant no. PCIG11-GA-2012-321675, e do programa Horizonte 2020 de investigação e inovação da União Europeia, a Convenção de subvenção n. º 664918-MRG-gramática.

1. preparação do sistema
<ol><li>Projeto de plasmídeos do ligação-local
	<ol>
<li>Projete a gaveta do local de ligação como representado na Figura 1. Cada que contém as seguintes peças (5 ' a 3 '): Eagl local de restrição, ~ 40 bases do 5 ' fim do canamicina (Kan) gene de resistência, pLac-ara promotor, Ribossoma Binding site (RBS), Aug do gene mcherry, um espaçador (δ), um local de ligação RBP, 80 bases do 5 ' final do gene mCherry, e um local de restriç?...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

O método descrito neste artigo facilita a medida in vivo quantitativa da afinidade obrigatória da RBP-RNA em pilhas de E. coli . O protocolo é relativamente fácil e pode ser conduzido sem o uso de maquinaria sofisticada, e a análise de dados é direta. Além disso, os resultados são produzidos imediatamente, sem o tempo de espera relativamente longo associado com os resultados de sequenciamento da próxima geração (NGS).
Uma limitação a este método é que trabalha somente e...

A regulação pós-transcricional de proteína de ligação de RNA (RBP), especificamente a caracterização da interação entre RBPs e RNA, tem sido extensivamente estudada nas últimas décadas. Existem vários exemplos de baixo-regulação translacional em bactérias originárias da inibição do rbps, ou diretamente competindo com, ligação Ribossome1,2,3. No campo da biologia sintética, as interações RBP-RNA estão surgindo como uma ferramenta significativa para o desenho de circuitos genéticos baseados em transcrição4,5. Portanto, há um aumento na demanda para caracterização dessas interações RBP-RNA em um contexto celular.
Os métodos mais comuns para o estudo das interações proteína-RNA são o ensaio eletroforético de deslocamento de mobilidade (EMSA)6, que é limitado a configurações in vitro, e vários ensaios pull-down7, incluindo o método de clipe8,9 . Quando tais métodos permiterem a descoberta de locais de ligação do RNA de de novo, sofrem dos inconvenientes tais como protocolos labor-intensivos e de reações de seqüenciamento profundas caras e podem exigir um anticorpo específico para a tração-para baixo de RBP. Devido à natureza suscetível do RNA ao seu ambiente, muitos fatores podem afetar as interações RBP-RNA, enfatizando a importância de interrogar a ligação RBP-RNA no contexto celular. Por exemplo, nós e outros temos demonstrado diferenças significativas entre as estruturas de RNA in vivo e in vitro10,11.
Baseado na aproximação de um estudo precedente12, Nós demonstramos recentemente10 que ao coloc locais obrigatórios pre-projetados para o capsídeo rbps dos bacteriófagos GA13, MS214, PP715, e qβ16 no região de iniciação de tradução de um repórter mRNA, a expressão do repórter é fortemente reprimido. Nós apresentamos um método relativamente simples e quantitativo, baseado neste fenômeno da repressão, para medir a afinidade entre RBPs e seu local de ligação RNA correspondentes in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

No passo de iniciação da tradução da proteína, o Ribossome liga-se à região de iniciação do mRNA. A iniciação da tradução pode ser obstruída pela ligação de uma proteína obrigatória do RNA (RBP) à região de iniciação do mRNA, que interfere com o emperramento ribossoma. No método apresentado, utilizamos este fenômeno de bloqueio para quantificar a afinidade vinculativa de RBPs aos seus locais de ligação cognato e não cognato. Para fazer isso, inserimos um site de vinculação de teste na região de iniciação de um mRNA de repórter e induzem a expressão do teste RBP. No caso da Associação RBP-RNA, observou-se uma repressão sigmoidal da expressão repórter em função da concentração de RBP. No caso de não afinidade ou de afinidade muito baixa entre o local de ligação e a RBP, não foi observada nenhuma repressão significativa. O método é realizado em células bacterianas ao vivo, e não requer maquinaria dispendiosa ou sofisticada. É útil para quantificar e comparar entre as afinidades de ligação de RBPs diferentes que são funcionais nas bactérias a um jogo de locais de ligação projetados. Este método pode ser inadequado para sites de ligação com alta complexidade estrutural. Isto é devido à possibilidade da repressão da iniciação ribosomal pela estrutura complexa do mRNA na ausência de RBP, que conduziria à expressão de gene mais baixa do repórter basal, e assim à repressão menos-Observable do repórter em cima da ligação de RBP.

O método apresentado utiliza a competição entre uma RBP e o Ribossome para ligação à molécula de mRNA (Figura 1). Esta competição é refletida pela diminuição dos níveis de mCherry em função do aumento da produção de RBP-mCerulean, devido ao aumento das concentrações de indutor. No caso de aumento da fluorescência de mCerulean, sem alterações significativas em mCherry, a falta de ligação à RBP é deduzada. Os resultados representativos...

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An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

A caracterização da ligação proteica ao RNA in vivo continua sendo um grande desafio devido à natureza complexa do RNA e aos muitos fatores que afetam sua interação com proteínas. A proteína de ligação RNA ou afinidade RBP-RNA é medida dentro de células bacterianas vivas. Uma vez que o ambiente celular afeta tanto a estrutura do RNA quanto a consequente ligação RBP-RNA, medir a afinidade in vivo é crucial para entender tais interações em sistemas naturais.O segredo do sucesso está no projeto dos plasmídeos. O design deve usar várias ondas de delta e evitar a inserção de códons stop e mutações de mudança de quadro. Inicie este protocolo projetando o do site de ligação.Cada mini gene contém um local de restrição de EagI, 40 bases da extremidade cinco prime do gene de resistência à kanamicina, o promotor pLac/Ara, o site de ligação ribossosome, AUG do gene mCherry, um espaçador, um site de ligação RBP, 80 bases da extremidade principal do gene mCherry, e um local de restrição ApaLI. Para aumentar a taxa de sucesso do ensaio, projete três de site de ligação para cada local de ligação com espaçadores compostos por pelo menos uma, duas e três bases. Digerir duas vezes os mini genes e o vetor alvo com EagI HF e ApaLI antes de realizar a purificação da coluna dos digestores.Ligate os mini genes digeridos à espinha dorsal do local de ligação contendo o resto do gene repórter mCherry, exterminador e um gene de resistência à kanamicina. Em seguida, transforme a solução de ligadura em Escherichia coli top 10 células. Depois de identificar transformadores positivos via sequenciamento Sanger, armazene plasmídeos purificados no formato 96 bem a menos 20 graus Celsius.Também armazene as cepas bacterianas como estoques de glicerol no formato 96 bem a menos 80 graus Celsius. Peça personalizada a sequência RBP necessária sem um códon de parada como um mini gene de DNA de dupla mente com locais de restrição nas extremidades. Transforme os plasmídeos preparados em células bacterianas quimicamente competentes que já contêm um plasmídeo RBP mCerulean.Para economizar tempo, aplaque as células usando uma pipetter de oito canais em oito placas de pista contendo ágar Luria-Bertani com antibióticos relevantes. Colônias devem aparecer em 16 horas a 37 graus Celsius. Selecione uma única colônia para cada duplo transformador e transfira para 48 placas de poço contendo 1,5 mililitros de LB com antibióticos apropriados.Cresça as células durante um período de 18 horas a 37 graus Celsius tremendo a 250 RPM. Armazene as pernoites como estoques de glicerol a menos 80 graus Celsius em 96 placas de poço. Pela manhã, programe o robô para aquecer 180 microliters de semi-poros médio ou SPM em 96 placas de poço.Programe o robô para preparar a placa indutora. Em uma placa limpa de 96 poços, prepare poços com SPM composto por 95%BA e 5%LB. O número de poços corresponde ao número desejado de concentrações indutoras.Adicione C4-HSL aos poços na placa indutora que conterá a maior concentração de indutores. Em seguida, programe o robô para diluir em série o meio de cada um dos poços de maior concentração em 23 concentrações mais baixas que variam de zero a 218 nanomolar. O volume de cada diluição indutora deve ser suficiente para todas as cepas.Para diluir as cepas durante a noite, programe o robô para diluir por um fator de 10 misturando 20 microliters de bactérias com 180 microliters de SPM em 48 placas de poço. Em seguida, diluir novamente por um fator de 10, tomando 20 microliters da solução diluída para a placa de tensão pré-preparada adequada para medição fluorescente. Agora programe o robô para adicionar o indutor diluído da placa indutora às 96 placas de poço com as cepas diluídas de acordo com as concentrações finais.Agite as 96 placas a 37 graus Celsius por seis horas. Durante esse tempo, faça medições da densidade óptica ou OD a 595 nanômetros, bem como mCherry e fluorescência mCerulean através de um leitor de placas a cada 30 minutos. Para fins de normalização, meça o crescimento da SPM sem células adicionadas.Aqui são tramas tridimensionais para uma tensão positiva. As tramas retratam níveis de OD brutos, fluorescência mCerulean e fluorescência mCherry em função do tempo e concentração de indutor. os níveis de expressão de estado estável mCerulean foram computados para cada concentração de indutor para as cepas positivas e negativas.A taxa de produção mCherry também foi calculada para cada concentração de indutor para cepas positivas e negativas. A taxa de produção de mCherry foi plotada em função da fluorescência média mCerulean média acima de duas duplicatas biológicas para duas cepas. O ajuste KRBP usando a fórmula de montagem é mostrado para a cepa positiva que exibe uma resposta de ligação específica.Para a cepa negativa, nenhum valor KRBP foi extraído. Foram determinadas curvas de resposta de dose normalizadas para 30 cepas diferentes com base em dois RBPs como 10 locais de ligação em locais diferentes. São observados três tipos de respostas, alta afinidade, baixa afinidade e nenhuma afinidade.Aqui são mostrados resultados quantitativos krbp para dois RBPs, proteína de casaco MS2 e proteína de casaco PP7 com 10 diferentes do local de ligação. Curvas de resposta de dose para proteína de casaco MS2 com um local de ligação mutante em quatro locais diferentes são mostradas aqui para demonstrar o efeito do espaçamento mutante na produção mCherry. A sequência do local de ligação mutante testado é mostrada.É importante usar uma técnica estrutural como a forma buscar sondar quimicamente a estrutura do complexo proteína-RNA e visualizar quais regiões de mRNA são afetadas pela ligação RNA. Recentemente, usamos essa técnica de forma de alto rendimento para medir simultaneamente a afinidade dos RBPs a 10.000 locais de vinculação.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Genética

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

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Quantificando pigmentação abdominal em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

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In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Engenharia genética de células de Dictyostelium discoideum com base na seleção e crescimento de bactérias

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...