Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
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Este proyecto recibió financiación del Programa I-CORE del Comité de Planificación y Presupuesto y de la Fundación Científica de Israel (Grant No 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675, y del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención no 664918 - MRG-Grammar.

1. Preparación del sistema
<ol><li>Diseño de plásmidos de sitio de encuadernación
	<ol>
<li>Diseñe el cassette del sitio de enlace como se muestra en la Figura1. Cada minigen contiene las siguientes partes (5' a 3'): sitio de restricción de Eagl, 40 bases del extremo de 5' del gen de resistencia de kanamicina (Kan), promotor pLac-Ara, sitio de unión ribosoma (RBS), AUG del gen mCherry, un espaciador ( ) , un sitio de unión RBP, 80 bases del extremo 5' del gen mCher...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

El método descrito en este artículo facilita la medición cuantitativa in vivo de la afinidad de unión RBP-ARN en células de E. coli. El protocolo es relativamente fácil y se puede llevar a cabo sin el uso de maquinaria sofisticada, y el análisis de datos es sencillo. Además, los resultados se producen inmediatamente, sin el tiempo de espera relativamente largo asociado con los resultados de la secuenciación de próxima generación (NGS).
Una limitación a este método es que ...

La regulación post-transcripción basada en proteína de unión al ARN (RBP), caracterizada específicamente de la interacción entre los PBP y el ARN, se ha estudiado extensamente en las últimas décadas. Hay múltiples ejemplos de regulación descendente traslacional en bacterias originadas por PBP que inhiben, o compiten directamente con, la unión ribosoma1,2,3. En el campo de la biología sintética, las interacciones RBP-ARN están emergiendo como una herramienta significativa para el diseño de circuitos genéticos basados en transcripción4,5. Por lo tanto, hay un aumento en la demanda de caracterización de tales interacciones RBP-ARN en un contexto celular.
Los métodos más comunes para estudiar las interacciones proteína-ARN son el ensayo de cambio de movilidad electroforético (EMSA)6, que se limita a entornos in vitro, y varios ensayos desplegables7,incluido el método CLIP8,9 . Si bien estos métodos permiten el descubrimiento de sitios de enlace de ARN novo, sufren de inconvenientes tales como protocolos intensivos en mano de obra y costosas reacciones de secuenciación profunda y pueden requerir un anticuerpo específico para la extracción de RBP. Debido a la naturaleza susceptible del ARN a su entorno, muchos factores pueden afectar las interacciones RBP-ARN, haciendo hincapié en la importancia de interrogar la unión RBP-ARN en el contexto celular. Por ejemplo, nosotros y otros hemos demostrado diferencias significativas entre las estructuras de ARN in vivo e in vitro10,11.
Basándonos en el enfoque de un estudio anterior12, recientemente demostramos10 que al colocar sitios de unión prediseñados para los PBP cápside de los bacteriófagos GA13, MS214, PP715y Q-16 en el región de iniciación de traducción de un ARNm reportero, la expresión del reportero está fuertemente reprimida. Presentamos un método relativamente simple y cuantitativo, basado en este fenómeno de represión, para medir la afinidad entre los PBP y su correspondiente sitio de unión de ARN in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

En el paso de iniciación de la traducción proteica, el ribosoma se une a la región de iniciación del ARNm. La iniciación de la traducción se puede bloquear mediante la unión de una proteína de unión al ARN (RBP) a la región de iniciación del ARNm, lo que interfiere con la unión ribosoma. En el método presentado, utilizamos este fenómeno de bloqueo para cuantificar la afinidad de unión de los BBP con sus sitios de enlace cognados y no cognados. Para ello, insertamos un sitio de enlace de prueba en la región de iniciación de un ARNm de reportero e inducemos la expresión de la RBP de prueba. En el caso de la unión RBP-RNA, observamos una represión sigmoidal de la expresión del reportero en función de la concentración de RBP. En el caso de la no afinidad o la afinidad muy baja entre el sitio de enlace y la RBP, no se observó una represión significativa. El método se lleva a cabo en células bacterianas vivas, y no requiere maquinaria costosa o sofisticada. Es útil para cuantificar y comparar entre las afinidades de unión de diferentes PBP que son funcionales en bacterias a un conjunto de sitios de unión diseñados. Este método puede ser inapropiado para sitios de enlace con alta complejidad estructural. Esto se debe a la posibilidad de represión de la iniciación ribosomal por compleja estructura de ARNm en ausencia de RBP, lo que resultaría en una expresión genética de reportero basal más baja, y por lo tanto una represión de reportero menos observable sobre la vinculación de la RBP.

El método presentado utiliza la competencia entre una RBP y el ribosoma para la unión a la molécula de ARNm (Figura1). Esta competencia se refleja en la disminución de los niveles de mCherry en función del aumento de la producción de RBP-mCerulean, debido al aumento de las concentraciones de inductor. En el caso del aumento de la fluorescencia de la macurrulenta, sin cambios significativos en el mCherry, se deduce la falta de unión RBP. Los resultados ...

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An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

La caracterización de la unión a proteínas al ARN in vivo sigue siendo un desafío importante debido a la naturaleza compleja del ARN y a los muchos factores que afectan su interacción con las proteínas. La proteína de unión al ARN o la afinidad RBP-ARN se mide dentro de las células bacterianas vivas. Dado que el entorno celular afecta tanto a la estructura del ARN como a la unión resultante al RBP-ARN, medir la afinidad in vivo es crucial para comprender tales interacciones en sistemas naturales.El secreto del éxito está en el diseño de los plásmidos. El diseño debe utilizar varias ondas de delta y evitar la inserción de codones de parada y mutaciones de cambio de marco. Comience este protocolo diseñando el casete del sitio de enlace.Cada mini gen contiene un sitio de restricción EagI, 40 bases del extremo final principal del gen de resistencia a la kanamicina, el promotor pLac/Ara, el sitio de unión ribosoma, AUG del gen mCherry, un espaciador, un sitio de unión RBP, 80 bases del extremo final de los cinco genes mCherry y un sitio de restricción de ApaLI. Para aumentar la tasa de éxito del ensayo, diseñe tres casetes de sitio de enlace para cada sitio de enlace con espaciadores que constan de al menos una, dos y tres bases. Digerir dos veces los mini genes y el vector objetivo con EagI HF y ApaLI antes de realizar la purificación de columnas de los resúmenes.Ligar los mini genes digeridos a la columna vertebral del sitio de unión que contiene el resto del gen del reportero mCherry, terminador y un gen de resistencia a la kanamicina. A continuación, transforme la solución de ligadura en Escherichia coli en las 10 células principales. Después de identificar transformantes positivos a través de la secuenciación de Sanger, almacene plásmidos purificados en el formato de 96 pozos a menos 20 grados centígrados.También almacenar las cepas bacterianas como stocks de glicerol en el formato de 96 pozos en menos 80 grados Celsius. Orden personalizado la secuencia RBP requerida que carece de un codón de parada como un mini gen de ADN de doble cadena con sitios de restricción en los extremos. Transforme los plásmidos preparados en células bacterianas químicamente competentes que ya contienen un plásmido mCeruleano RBP.Para ahorrar tiempo, vajilla las células usando un pipeteador de ocho canales en placas de ocho carriles que contienen agar Luria-Bertani con antibióticos relevantes. Las colonias deben aparecer en 16 horas a 37 grados centígrados. Seleccione una sola colonia para cada doble transformador y transfiera a 48 placas de pozo que contengan 1,5 mililitros de LB con antibióticos apropiados.Cultivar las células durante un período de 18 horas a 37 grados Celsius temblando a 250 RPM. Almacene las pernoctaciones como existencias de glicerol a menos 80 grados centígrados en placas de 96 pozos. Por la mañana, programe el robot para calentar 180 microlitros de medio semi-poro o SPM en 96 placas de pozo.Programe el robot para preparar la placa inductor. En una placa limpia de 96 pozos, prepare pozos con SPM que consta de 95%BA y 5%LB. El número de pozos corresponde al número deseado de concentraciones de inductores.Añadir C4-HSL a los pozos en la placa inductor que contendrá la mayor concentración de inductores. A continuación, programe el robot para diluir en serie el medio de cada uno de los pozos de mayor concentración en 23 concentraciones más bajas que van de cero a 218 nanomolares. El volumen de cada dilución del inductor debe ser suficiente para todas las cepas.Para diluir las cepas de la noche, programe el robot para que se diluya por un factor de 10 mezclando 20 microlitros de bacterias con 180 microlitros de SPM en 48 placas de pozo. A continuación, diluir de nuevo por un factor de 10 tomando 20 microlitros de la solución diluida en la placa de tensión pre-preparada adecuada para la medición fluorescente. Ahora programe el robot para añadir el inductor diluido de la placa inductor a las placas de 96 pozos con las cepas diluidas de acuerdo con las concentraciones finales.Agitar las placas de 96 pozos a 37 grados centígrados durante seis horas. Durante ese tiempo, tome medidas de la densidad óptica u OD a 595 nanómetros, así como de la fluorescencia mCherry y mCerulean a través de un lector de placas cada 30 minutos. Para fines de normalización, mida el crecimiento de SPM sin células añadidas.Aquí se muestran parcelas tridimensionales para una cepa positiva. Las gráficas representan los niveles de OD crudos, la fluorescencia mCerulean y la fluorescencia mCherry en función del tiempo y la concentración del inductor. Se calcularon los niveles de expresión de estado estacionario de mCerulean para cada concentración de inductor para las cepas positivas y negativas.La tasa de producción de mCherry también se calculó para cada concentración de inductor para cepas positivas y negativas. La tasa de producción de mCherry se estableció en función de la fluorescencia mceruleana media de más de dos duplicados biológicos para dos cepas. El ajuste KRBP utilizando la fórmula de ajuste se muestra para la tensión positiva que exhibe una respuesta de unión específica.Para la cepa negativa, no se extrajo ningún valor KRBP. Las curvas de respuesta a dosis normalizadas se determinaron para 30 cepas diferentes basadas en dos PBP como 10 sitios de unión en diferentes ubicaciones. Se observan tres tipos de respuestas, alta afinidad, baja afinidad y sin afinidad.Aquí se muestran resultados cuantitativos de KRBP para dos RBP, proteína de recubrimiento MS2 y proteína de recubrimiento PP7 con 10 casetes de sitio de unión diferentes. Las curvas de respuesta a la dosis para la proteína de recubrimiento MS2 con un sitio de unión mutada en cuatro ubicaciones diferentes se muestran aquí para demostrar el efecto del espaciado mutante en la producción de mCherry. Se muestra la secuencia del sitio de enlace mutado probado.Es importante utilizar una técnica estructural como la forma de buscar químicamente la estructura del complejo proteína-ARN y visualizar qué regiones de ARNm se ven afectadas por la unión al ARN. Recientemente, utilizamos esta técnica de una manera de alto rendimiento para medir simultáneamente la afinidad de los RMP a 10.000 sitios de enlace.

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