Name: an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

Detta projekt fick finansiering från i-CORE program för planering och budgetering kommittén och Israel Science Foundation (Grant nr 152/11), Marie Curie återintegrering Grant No. PCIG11-GA-2012-321675, och från Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och Innovations program enligt bidragsavtal nr 664918-MRG-grammatik.

1. system förberedelse
<ol><li>Konstruktion av bindplatplasmider
	<ol>
<li>Utforma kassetten för bindnings platsen enligt figur 1. Varje minigene innehåller följande delar (5 ' till 3 '): Eagl begränsning webbplats, ∼ 40 baser av 5 ' slutet av kanamycin (kan) Resistance Gene, pLac-Ara promotor, Ribosomen bindnings plats (RBS), AUG av mCherry genen, en spacer (δ), en RBP bindnings plats, 80 baser av 5 ' End av mCherry-genen och en ApaLI-restriktionsssida. <strong...

<ol>
	<li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein.">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li><li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins.">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li><li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria.">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).</li><li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology:+new+mechanisms,+applications+and+tools+for+the+future.">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li><li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells.">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).</li><li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein.">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).</li><li>Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells.">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li><li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li><li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions.">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li><li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene.">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li><li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch.">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li><li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA.">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li><li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein.">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li><li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein.">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li><li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q&#946;+Coat+Protein.">The RNA-binding Site of Bacteriophage Q&#946; Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018)</li><li>. Wizard&#174; SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018)</li><li>. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018)</li><li>. Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018)</li><li>. NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018)</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018)</li><li>. Making your own chemically competent cells Available from: <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018)</li><li>. Luria-Bertani (LB) Medium Preparation &#183; Benchling Available from: <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018)</li><li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo.">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li><li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences.">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features.">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li><li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo.">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2&#8217;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2&#8217;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li><li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms.">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486 (2015).</li><li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq.">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).</li><li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE.">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li><li>Bernardi, A., Spahr, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17.">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li></ol>

Den metod som beskrivs i denna artikel underlättar kvantitativ in vivo-mätning av RBP-RNA-bindningsaffinitet i E. coli -celler. Protokollet är relativt enkelt och kan genomföras utan användning av sofistikerade maskiner, och dataanalys är enkel. Dessutom resultaten produceras omedelbart, utan den relativt långa väntetiden i samband med nästa generations sekvensering (NGS) resultat.
En begränsning av denna metod är att det fungerar endast i bakterie-celler. Men en tidigare s...

RNA-bindande protein (RBP)-baserad post-transkriptionell reglering, särskilt karakterisering av samspelet mellan RBPs och RNA, har studerats i stor utsträckning under de senaste decennierna. Det finns flera exempel på translationell Down-reglering hos bakterier som härstammar från RBPs-hämmande, eller direkt konkurrerar med, ribosom bindning1,2,3. Inom området syntetisk biologi, RBP-RNA interaktioner växer fram som ett viktigt verktyg för utformningen av transkription-baserade genetiska kretsar4,5. Därför finns det en ökning av efterfrågan på karakterisering av sådana RBP-RNA interaktioner i en cellulär kontext.
De vanligaste metoderna för att studera protein-RNA interaktioner är den elektroforetiska Mobility Shift assay (EMSA)6, som är begränsad till in vitro-inställningar, och olika pull-down-analyser7, inklusive Clip metod8,9 . Även om sådana metoder möjliggör upptäckten av de Novo RNA bindningsställen, de lider av nackdelar såsom arbetsintensiva protokoll och dyra djupsekvensering reaktioner och kan kräva en specifik antikropp för RBP pull-down. På grund av den mottagliga karaktären av RNA till sin omgivning, många faktorer kan påverka RBP-RNA interaktioner, betonar vikten av förhör RBP-RNA bindning i cellulära sammanhang. Till exempel har vi och andra visat signifikanta skillnader mellan RNA-strukturer in vivo och in vitro-10,11.
Baserat på tillvägagångssättet i en tidigare studie12, visade vi nyligen10 att när du placerar på förhand utformade bindningsställen för kapsid RBPs från bakteriophages ga13, MS214, PP715, och qβ16 i översättnings initiering region för en reporter mRNA, reporter uttryck är starkt nedtryckt. Vi presenterar en relativt enkel och kvantitativ metod, baserad på detta förtryck fenomen, för att mäta affinitet mellan RBPs och deras motsvarande RNA-bindningsställes in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>ALFA AESAR</td>
			<td>33337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-5ML-48-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8- lane plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>RESMW8I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates for plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding site sequences</td>
			<td>Gen9 Inc. and Twist Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli TOP10 cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagl-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>071205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubator</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>liconic incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin solfate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI- HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid-handling robotic system</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>EVO 100, MCA 96-channel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi- pipette 8 lanes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>BR703710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td>
			<td>cayman</td>
			<td>K40982552 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>020235A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platereader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 HotStart Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBP seqeunces</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27121 &#38; 40650</td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM CHLORIDE (NaCL)</td>
			<td>BIO LAB</td>
			<td>190305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an assay for quantifying protein-rna binding in bacteria

I inlednings steget av protein omräkning binder ribosom binds till initierings regionen av mRNA. Initiering av översättningen kan blockeras genom bindning av ett RNA-bindande protein (RBP) till initierings regionen för mRNA, som stör ribosom bindning. I den presenterade metoden använder vi detta blockerande fenomen för att kvantifiera bindningsaffiniteten hos RBPs till deras besläktat och icke-kognate bindningsställen. För att göra detta infogar vi en test bindnings plats i initierings regionen för en reporter mRNA och inducerar uttrycket för test-RBP. När det gäller RBP-RNA-bindning, observerade vi en sigmodala förtryck av reportern uttryck som en funktion av RBP koncentration. I fråga om ingen affinitet eller mycket låg affinitet mellan bindningsstället och RBP observerades inget signifikant förtryck. Metoden utförs i levande bakterieceller och kräver inte dyra eller sofistikerade maskiner. Det är användbart för att kvantifiera och jämföra mellan de bindande tillhörighet av olika RBPs som är funktionella i bakterier till en uppsättning utformade bindnings platser. Denna metod kan vara olämplig för bindningsställen med hög strukturell komplexitet. Detta är tack vare möjligheten av repression av ribosomal påbörjande vid komplex mRNA strukturerar i frånvaroen av RBP, som skulle resultat i lägre basal reporter genuttryck, och thus mindre-observable reporter repression på RBP-bindning.

Den presenterade metoden utnyttjar konkurrensen mellan en RBP och ribosom för bindning till mRNA-Molekylen (figur 1). Denna konkurrens återspeglas genom att minska mCherry nivåer som en funktion av ökad produktion av RBP-mCerulean, på grund av ökande koncentrationer av inducerare. När det gäller att öka mCerulean fluorescens, utan betydande förändringar i mCherry, är en brist på RBP bindning härledas. Representativa resultat för både en positi...

Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria at JoVE.com

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ett test för att kvantifiera protein-RNA-bindning i bakterier

I denna metod, vi kvantifiera bindningen affiniteten av RNA bindande proteiner (RBPs) till besläktat och icke-kognate bindningsställen med hjälp av en enkel, levande, reporter assay i bakterieceller. Analysen bygger på förtryck av en reporter gen.

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Karakterisering av proteinbindning till RNA in vivo är fortfarande en stor utmaning på grund av RNA:s komplexa natur och de många faktorer som påverkar dess interaktion med proteiner. RNA-bindningsprotein eller RBP-RNA-tillhörighet mäts inuti levande bakterieceller. Eftersom cellulär miljö påverkar både RNA-strukturen och den resulterande RBP-RNA-bindningen, är mätning av affiniteten in vivo avgörande för att förstå sådana interaktioner i naturliga system.Hemligheten till framgång är i utformningen av plasmiderna. Konstruktionen bör använda flera vågor av delta och undvika insättning av stopp kodon och frameshift mutationer. Börja detta protokoll genom att utforma bindningsplatskassetten.Varje mini gen innehåller en EagI begränsning webbplats, 40 baser från de fem främsta slutet av kanamycin resistens genen, pLac/ Ara promotorn, ribosom bindande webbplats, AUG av mCherry genen, en spacer, en RBP bindande webbplats, 80 baser från fem främsta änden av mCherry genen, och en ApaLI begränsning webbplats. För att öka andelen framgångsrika analysen, design tre bindande webbplats kassetter för varje bindningsställe med distanser som består av minst en, två och tre baser. Dubbelsmältning både minigenerna och målvektorn med EagI HF och ApaLI innan du utför kolumnrening av smälten.Ligate de smälta minigenerna till den bindande platsen ryggraden som innehåller resten av mCherry reporter genen, terminator och en kanamycin resistens gen. Omvandla sedan ligaturlösningen till Escherichia coli topp 10 celler. Efter att ha identifierat positiva transformanter via Sanger-sekvensering, förvarar du renade plasmider i 96-brunnsformatet vid minus 20 grader Celsius.Förvara även bakteriestammarna som glycerollager i 96 års brunnsformat vid minus 80 grader Celsius. Anpassad ordning krävs RBP sekvens saknar ett stopp kodon som en dubbelsträngad DNA mini gen med begränsning platser i ändarna. Omvandla de beredda plasmiderna till kemiskt kompetenta bakterieceller som redan innehåller en RBP mCerulean plasmid.För att spara tid, platta cellerna med hjälp av en åtta kanal pipetter på åtta körfält plattor som innehåller Luria-Bertani agar med relevanta antibiotika. Kolonier ska dyka upp i 16 timmar vid 37 grader Celsius. Välj en enda koloni för varje dubbel transformant och överför till 48 brunnsplattor som innehåller 1,5 milliliter lb med lämpliga antibiotika.Odla cellerna under en period av 18 timmar vid 37 grader Celsius skakar vid 250 RPM. Förvara övernattningarna som glycerollager på minus 80 grader Celsius i 96 brunnsplattor. På morgonen, programmera roboten att värma 180 mikroliter av semi-por medium eller SPM i 96 brunnsplattor.Programmera roboten att förbereda inducerplåten. I en ren 96 brunnsplatta, förbered brunnar med SPM bestående av 95%BA och 5%LB. Antalet brunnar motsvarar det önskade antalet inducerkoncentrationer.Tillsätt C4-HSL till brunnarna i inducerskivan som kommer att innehålla den högsta inducerkoncentrationen. Därefter programmerar roboten att seriebespä ut medium från var och en av de högsta koncentrationsväldarna till 23 lägre koncentrationer från noll till 218 nanomolar. Volymen av varje inducerningsutspädning bör vara tillräcklig för alla stammar.För att späda ut över natten stammar, programmera roboten att späda ut med en faktor 10 genom att blanda 20 mikroliter av bakterier med 180 mikroliter av SPM i 48 brunnsplattor. Späd sedan ut igen med en faktor på 10 genom att ta 20 mikroliter från den utspädda lösningen i den färdigberedda stamplattan som är lämplig för fluorescerande mätning. Programmera nu roboten att lägga till den utspädda induceraren från inducerplattan till de 96 brunnsplattorna med de utspädda stammarna enligt de slutliga koncentrationerna.Skaka de 96 brunnsplattorna vid 37 grader Celsius i sex timmar. Under den tiden, ta mätningar av den optiska densiteten eller OD vid 595 nanometer samt mCherry och mCerulean fluorescens via en tallriksläsare var 30:e minut. För normalisering ändamål, mäta tillväxten av SPM med inga celler till.Visas här är tredimensionella tomter för en positiv stam. De tomter skildra råa OD nivåer, mCerulean fluorescens, och mCherry fluorescens som en funktion av tid och inducerare koncentration. mCerulean steady-state uttryck nivåer beräknades för varje inducerare koncentration för både positiva och negativa stammar.Den mCherry produktionstakten var också beräknas för varje inducerare koncentration för både positiva och negativa stammar. mCherry produktionstakt ritades som en funktion av medelvärdet mCerulean fluorescens i genomsnitt över två biologiska dubbletter för två stammar. Den passnings-KRBP som använder den passande formulan visas för den positiva stam som uppvisar ett specifikt bindningssvar.För den negativa stammen extraherades inget KRBP-värde. Normaliserade dos responskurvor fastställdes för 30 olika stammar baserat på två RBPs som 10 bindningsställen på olika platser. Tre typer av svar observeras, hög affinitet, låg affinitet och ingen affinitet.Visas här är kvantitativa KRBP resultat för två RBPs, MS2 coat protein och PP7 coat protein med 10 olika bindning webbplats kassetter. Dos responskurvor för MS2 coat protein med ett mutantbindningsställe på fyra olika platser visas här för att visa effekten av mutantavståndet på mCherry-produktionen. Sekvensen för det testade muterade bindningsstället visas.Det är viktigt att använda en strukturell teknik som form försöker kemiskt sond strukturen av protein-RNA-komplexet och att visualisera vilka mRNA regioner påverkas av RNA bindning. Nyligen använde vi denna teknik i en hög genomströmning sätt att samtidigt mäta affinitet av RBPs till 10, 000 bindande platser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-bindande DNA fånga sekvensering för patientvävnader

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Förfarande för adaptiv Laboratory Evolution av mikroorganismer med hjälp av en kemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Nya RNA-bindande proteiner Isolering av den snabba Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sekventiell Salt extraktioner för analys av Bulk kromatin bindande egenskaper av kromatin ändra komplex

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantifiering av bukpigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Mareld Assay att karakterisera dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknik Dictyostelium discoideum celler baserat på urval och tillväxt på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Utforska Sekvensutrymme för att identifiera bindnings platser för regulatoriska RNA-bindande proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...