SEC-MALS는 용액에서 거대 분자의 분자량, 크기 및 형성을 결정하는 정량적 방법입니다. 그것은 올리고머와 복합체를 식별하고, 당단백질 및 막 단백질같이 어려운 견본을 특성화할 수 있습니다. SEC-MALS는 절대적인 방법입니다.
그것은 기본적인 물리학에 의존하고, 분자 표준, 분자의 형성, 또는 우리가 분리 매체와 상호 작용하는 방법에 대하여 협력에 의존하지 않습니다. SEC-MALS는 초별로 구분되는 많은 시스템에 적용할 수 있습니다. 펩티드와 작은 폴리머에서 단백질, 뉴클레오캡시드, 다당류, 합성 폴리머, 바이러스와 같은 입자 및 작은 바이러스에 이르기까지.
시스템 및 버퍼가 낮은 미립자 콘텐츠에 대한 공급업체의 권장 사항을 놓치고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 공급업체의 기술 지원 담당자와 상의하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SEC-MALS 시스템을 준비하여 이 절차를 시작합니다.
각 PLC 급 시약을 사용하여 50~100밀리알라 나트륨염화와 인산완충식식염수 1리터를 준비한다. 병에 든 폴레터 세포 폼 필터 또는 이와 유사한 버퍼를 0.1 미크론으로 필터링합니다. 건조 필터에서 미립자를 제거하기 위해 처음 50 내지 100 밀리리터의 완충기를 폐병에 걸러내십시오.
그런 다음, 이전에 여과, 탈이온 된 물로 세척하고 먼지가 유입되지 않도록 보관 된 깨끗하고 멸균 병에 나머지를 필터링합니다. 버퍼의 컬럼을 평형화하고 미립자를 제거하기 위해 분당 0.5 밀리리터의 유속도로 하룻밤 동안 컬럼을 플러시합니다. FPLC의 연속 흐름 모드를 사용하고 모든 SEC-MALS 실행이 완료될 때까지 흐름이 중지되지 않도록 합니다.
밤새 플러시 동안 DRI 유동 셀을 퍼지 모드로 배치합니다. 플러시를 시작할 때, 컬럼의 급격한 압력 변화로 인한 열 흘리기 효과를 방지하기 위해 흐름 속도를 점진적으로 램프합니다. 샘플 실행을 시작하기 전에 퍼지를 끕니다.
컬럼의 튜브 다운스트림을 가볍게 눌러 축적된 입자를 방출하여 시스템 청결을 확인합니다. MALS 계측기의 전면 패널 디스플레이에 있는 90도 검출기에서 신호를 관찰한다. 피크-투-피크 노이즈가 50-100 마이크로볼트 이하인지 확인합니다.
또한 굴절률 또는 RI 신호가 마이너스 7 굴절 지수 단위로 10배 미만으로 안정되어 있는지 확인합니다. 인젝터가 입자가 깨끗한지 확인하기 위해 빈 주입을 수행합니다. 공백은 단순히 신선하고 멸균 된 유리병에 준비 된 실행 버퍼입니다.
파티클 피크가 볼륨이 1밀리리터 이상이고 기준선 위에 5밀리볼트 를 초과하지 않는 경우 시스템은 샘플을 만들 준비가 되어 있습니다. 그렇지 않으면, 깨끗 한 때까지 추가 빈 주사를 수행, 또는 인젝터를 청소 하는 유지 보수를 수행. 이제 SCC 버퍼에서 밀리리터당 1~2밀리그램으로 최소 200마이크로리터의 BSA를 준비합니다.
주사기 팁 필터를 사용하여 단백질을 02 미크론으로 필터링합니다. 건조 필터에서 입자를 제거하기 위해, 여과의 처음 몇 방울을 폐기합니다. 또는, 원심분리시 시료를 10배, 000배 G로 15분 동안 15분간 하여 불용성 골집 및 기타 큰 입자의 침전을 가능하게 한다.
그런 다음 BSA 용액의 100 마이크로리터를 루프에 주입합니다. MALS 소프트웨어 메뉴에서 메서드에서 새 실험을 엽니다. 그런 다음, 라이트 산란 시스템 방법 폴더에서 온라인 방법을 선택합니다.
DLS 검출기가 있는 경우 QELS 폴더가 있는 라이트 산란에서 온라인 방법을 선택합니다. 구성 섹션에서 샘플 및 모바일 단계의 매개 변수를 설정합니다. 일반 펌프 뷰에서 유량을 FPLC에 사용된 것으로 설정합니다.
그런 다음 일반 펌프 뷰, 용매 분기, 이름 필드로 이동하여 PBS를 선택합니다. 인젝터 뷰에서 샘플 분기는 이름을 BSA로 입력합니다. dn/dc를 0.185로 설정하고 A2를 0으로 설정하고 UV 소멸 계수를 밀리그램 센티미터당 0.667 밀리리터로 설정합니다.
프로시저 섹션에서 기본 컬렉션 보기는 자동 주입시 확인란 트리거를 선택합니다. 실행 기간을 70분으로 설정하여 SEC 열의 총 투과 볼륨에 도달할 때까지 전체 암시에 대해 데이터를 수집합니다. 실행 버튼을 클릭하여 MALS 소프트웨어에서 실험을 시작합니다.
MALS 검출기를 통해 FPLC 계측기로부터 펄스 신호를 받은 후 데이터를 읽기 시작합니다. 계측기 전면 패널의 자동 제로 버튼을 클릭하여 DRI 신호를 0으로 설정합니다. FPLC 소프트웨어에서 작업하고 수동으로 이동하여 수동 지침을 실행하고 마크를 설정하고 단백질 및 실행이름을 삽입합니다.
분사 밸브를 수동 하중에서 주입, 흐름 경로 에서 사출 밸브로 전환합니다. IO 박스 펄스 디지털 아웃 아래에 0.5초 펄스를 삽입하여 펄스 신호를 포함한다. 이렇게 하면 MALS 소프트웨어의 데이터 수집이 트리거됩니다.
이제 샘플을 루프에 삽입합니다. FPLC 소프트웨어에서 실행을 클릭하여 실험 실행을 시작합니다. MALS 소프트웨어의 절차 섹션에서 분석을 단계별로 수행합니다.
기본 컬렉션 보기를 확인하여 UV, MALS 및 RI에서 피크가 거의 동일한 암시 볼륨에 나타나는지 확인합니다. 기준선 보기에서 모든 신호에 대한 기준선을 정의합니다. 피크 뷰에서 마우스를 클릭하고 드래그하여 분석할 피크를 정의합니다.
각 피크의 중앙 50%를 선택합니다. 먼저 단조로운 피크를 선택한 다음 디머 피크를 선택합니다. 각 피크에서 BSA의 경우 280 나노미터에서 dn/dc 및 소멸 계수의 정확한 값을 확인합니다.
프로시저에서 정렬 보기는 마우스를 클릭하고 드래그하여 피크의 중앙 영역을 선택합니다. 신호를 정렬한 다음 괜찮습니다. 절차에서 밴드 확대 보기는 단량제 피크의 중앙 50%를 선택합니다.
굴절률 검출기가 참조 계측기로 지정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 적합성을 클릭하고 UV 및 광 산란 신호를 굴절 인덱스 신호에 일치하도록 적용합니다. 피크를 확대하여 중앙 50~70%에서 매우 밀접하게 겹치는지 확인한 다음 확인을 클릭합니다.
프로시저에서 정규화 보기는 피크 뷰를 선택합니다. RG 값으로 3.0 나노미터를 입력하고 정규화한 다음 확인을 클릭합니다. EASI 그래프 보기에서 결과의 그래프를 봅니다.
창 상단의 디스플레이 드롭다운에서 어금니 질량을 선택합니다. 컨트롤을 사용 하 여 클릭 하 고 최대 영역으로 확대 하려면 드래그합니다. 단조량및 이량피크에 대한 최종 표고 중량 평균 어금산질량 결과를 보려면 피크 결과, 어금니 질량 모멘트, MW로 이동하여 결과를 요약보고합니다.
순도는 피크 결과, 질량 분수에서 보고됩니다. 파일 메뉴에서 메서드로 저장을 선택하고 분석된 BSA 데이터를 모든 유형의 단백질을 향후 측정하기 위한 표준 방법으로 저장합니다. BSA에 대해 결정된 정규화 및 대역 확대 매개변수는 분석에서 이월됩니다.
여기에 200 Angstrom 모공 크기 제외 열을 사용하여 BSA의 SEC-MALS 분석이 표시됩니다. 크로마토그램 트레이스는 단조림 피크로 정규화되고 선명도를 위해 오프셋됩니다. 무시할 수 있는 일반적인 아티팩트는 빛 산란 신호의 시작 부분에 있는 입자 피크뿐만 아니라 굴절률 신호의 총 투과량 근처의 염및 용해된 공기 피크를 포함한다는 지적이다.
크로마토그램은 뛰어난 단량제-디머 트리머 분리를 나타내며, 광 산란 신호는 소음에 높은 신호를 나타낸다. 단조량 및 이머 중량 평균 어금산 질량 값은 높은 균질성을 나타낸다. 다음은 저품질 SEC-MALS 분석의 예입니다.
이 예에서, 75 Angstrom 모공 크기 배제 열에 부적당한 분리는 단백질에서 잘 분리되지 않는 8 9 분 사이 입자 피크를 초래합니다. 여기서, 노이즈 비에 대한 부적절한 신호가 있고, 단백질에 인접한 광대한 입자는 광 산란 신호에서 명백하다. 좋은 SEC-MALS 결과의 키는 적절한 열을 선택하여 시스템이 저조도 산란 노이즈로 보정되도록 하고, 입자를 제거하기 위해 샘플을 사전 필터링 하거나 원심분리합니다.
SEC-MALS에 이어, 단백질 샘플은 결합 친화성, 바이오리자, 표면 플라스몬 공명, 이더피 적정 열량량, 생물건조성 포롬법, 미세스케일 열광, 또는 조성 그라데이션, 다각광 산란을 위해 추가로 분석될 수 있다. 단백질 구조는 엑스레이 결정학, 극저온 전자 오곡사법, 또는 NMR에 의해 결정될 수 있다.
