Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

SEC-MALS é um método quantitativo para determinar o peso molecular, tamanho e conformação de macromoléculas na solução. Pode identificar oligômeros e complexos, e caracterizar amostras difíceis, como glicoproteínas e proteínas de membrana. SEC-MALS é um método absoluto.

Ela se baseia na física fundamental, e não depende da colaboração contra padrões moleculares, da conformação da molécula ou de como interagimos com o meio de separação. O SEC-MALS pode ser aplicado a muitos sistemas separados por sec. De peptídeos e pequenos polímeros a proteínas, nucleocapsídeos, polissacarídeos, polímeros sintéticos, partículas semelhantes a vírus e pequenos vírus.

É importante verificar se seu sistema e buffers perdem as recomendações do fornecedor para baixo conteúdo de partículas. Consulte o representante de suporte técnico do fornecedor para ter certeza. Inicie este procedimento com a elaboração do sistema SEC-MALS, conforme descrito no protocolo de texto.

Utilizando cada reagente de grau PLC, prepare um litro de soro fisiológico tamponado com cloreto de sódio de 50 a 100 mililitros. Filtre o buffer para 0,1 míclico usando um filtro de espuma de célula poliether engarrafado ou similar. Filtre os primeiros 50 a 100 mililitros de tampão em uma garrafa de resíduos, a fim de eliminar as partículas dos filtros secos.

Em seguida, filtre o restante para uma garrafa limpa e estéril que tenha sido previamente lavada com água filtrada e desionizada e mantida para evitar a entrada de poeira. Lave a coluna durante a noite a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto para equilibrar a coluna no buffer e remover partículas. Use o modo de fluxo contínuo do FPLC e certifique-se de que o fluxo não pare até que todas as corridas SEC-MALS estejam concluídas.

Coloque a célula de fluxo DRI no modo de purga durante a descarga durante a noite. Ao iniciar a descarga, aumente gradualmente a vazão para evitar que a coluna desabafe, causada por uma mudança brusca de pressão na coluna. Desligue o expurgo antes de iniciar a amostra.

Verifique a limpeza do sistema tocando levemente o tubo rio abaixo da coluna para liberar partículas acumuladas. Observe o sinal no detector de 90 graus no visor do painel frontal do instrumento MALS. Verifique se o ruído de pico ao pico não é mais do que 50-100 microvolts.

Verifique também se o índice de refração, ou sinal RI, está estável para menos de 1 vezes dez para as sete unidades de índice refrativo menos. Realize uma injeção em branco para verificar se o injetor está limpo de partículas. Um branco é simplesmente o tampão de corrida preparado em um frasco fresco e estéril.

Se o pico de partículas não for superior a um mililitro em volume, e não mais do que cinco milivolts acima da linha de base, então o sistema está pronto para amostras. Caso contrário, realize injeções adicionais em branco até limpar ou realize a manutenção para limpar o injetor. Agora, prepare pelo menos 200 microliters de BSA a um a dois miligramas por mililitro no buffer SCC.

Filtre a proteína em 02 mícrons, usando um filtro de ponta de seringa. Descarte as primeiras gotas de filtrado, a fim de eliminar partículas dos filtros secos. Alternativamente, centrifugar a amostra a 10.000 vezes G durante quinze minutos para permitir a precipitação de agregados não solúveis e outras partículas grandes.

Em seguida, injete 100 microliters da solução BSA no loop. Abra novo experimento do método no menu de software MALS. Em seguida, selecione o método on-line na pasta de métodos do sistema de dispersão de luz.

Se um detector DLS estiver presente, selecione o método on-line da dispersão de luz com a pasta QELS. Defina parâmetros da amostra e da fase móvel na seção de configuração. Na visão genérica da bomba, defina a taxa de fluxo para a usada no FPLC.

Em seguida, navegue até a visualização genérica da bomba, ramo solvente, campo de nome e selecione PBS. Na visão do injetor, ramo amostral, digite o nome como BSA. Defina dn/dc para 0,185, defina A2 para 0 e defina o Coeficiente de Extinção UV para 0,667 mililitros por centímetro miligrama.

Na seção procedimentos, visualização básica da coleta, selecione o gatilho da caixa de seleção na injeção automática. Defina a duração da execução para 70 minutos, para que os dados sejam coletados durante toda a alusão, até que o volume total de permeação da coluna SEC seja atingido. Inicie o experimento no software MALS clicando no botão executar.

Ele começará a ler os dados após receber o sinal de pulso do instrumento FPLC através do detector MALS. Zero o sinal DRI clicando no botão auto-zero no painel frontal do instrumento. Trabalhando no software FPLC, navegue até manualmente, execute instruções manuais, marque e insira o nome da proteína e a execução.

Troque a válvula de injeção da carga manual para injetar, sob o caminho de fluxo, válvula de injeção. Inclua um sinal de pulso inserindo um pulso de 0,5 segundo sob o pulso digital da caixa IO. Isso desencadeará a coleta de dados no software MALS.

Agora, injete a amostra no loop. Clique em executar no software FPLC para iniciar a execução do experimento. Realize a análise passo a passo, sob a seção de procedimentos no software MALS.

Verifique se os picos aparecem aproximadamente no mesmo volume de alusão em UV, MALS e RI verificando a visualização básica da coleção. Na visão da linha de base, defina a linha de base para todos os sinais. Na visualização dos picos, defina os picos a serem analisados clicando e arrastando o mouse.

Selecione os 50% centrais de cada pico. Primeiro selecione o pico do monômero, e depois o pico mais escuro. Sob cada pico, verifique os valores corretos do dn/dc e do coeficiente de extinção em 280 nanômetros para BSA.

Nos procedimentos, veja a região central dos picos clicando e arrastando o mouse. Clique em alinhar sinais e, em seguida, ok. Nos procedimentos, a ampliação da faixa, escolha os 50% centrais do pico do monômero.

Certifique-se de que o detector de índices de refração está especificado como o instrumento de referência. Em seguida, clique em executar ajuste e aplicar para combinar os sinais de dispersão UV e luz ao sinal de índice de refração. Amplie os picos para verificar se eles se sobrepõem muito de perto dentro da central de 50 a 70% e, em seguida, clique bem.

Nos procedimentos, visualização de normalização, selecione o pico um. Digite 3.0 nanômetros como o valor do RG, clique em normalizar e clique em ok. Veja o gráfico dos resultados na exibição do gráfico EASI.

Selecione massa molar do display na parte superior da janela. Use controle, clique e arraste para ampliar a região de pico. Para ver os resultados finais de massa molar médio de peso tabulado para os picos mais monômeros e mais escuros, navegue até os picos de pico, momentos de massa molar, MW e selecione os resultados, resumo do relatório.

A pureza é relatada sob os resultados de pico, fração de massa. No menu de arquivos, selecione salvar como método e salve os dados BSA analisados como um método padrão para medições futuras de todos os tipos de proteínas. Os parâmetros de normalização e ampliação da banda determinados para a BSA serão realizados na análise.

Aqui são mostradas análises SEC-MALS da BSA, usando uma coluna de exclusão de tamanho de poros Angstrom de 200. Os traços de cromatograma são normalizados até o pico do monômero, e compensados para clareza. Artefatos comuns que podem ser ignorados são apontados, incluindo um pico de partículas perto do início do sinal de dispersão de luz, bem como picos de ar salgado e dissolvido perto do volume total de permeação no sinal de índice de refração.

O cromatógrama exibe excelente separação monômero-mais fino, e o sinal de dispersão de luz exibe alto sinal de ruído. Os valores médios de massa molar de peso mais fino e mais fraco apresentam alta homogeneidade. Aqui estão exemplos de análises SEC-MALS de baixa qualidade.

Neste exemplo, a separação inadequada em uma coluna de exclusão de tamanho de poros de 75 Angstrom resulta em um pico de partículas entre oito a nove minutos, que não é bem separado das proteínas. Aqui, há uma relação sinal-ruído inadequado, e partículas extensas adjacentes às proteínas são aparentes no sinal de dispersão de luz. As chaves para bons resultados DO SEC-MALS estão selecionando uma coluna apropriada, garantindo que o sistema seja calibrado com ruído de dispersão de pouca luz e pré-filtrando ou centrifugando as amostras para remover partículas.

Seguindo a SEC-MALS, as amostras de proteínas podem ser analisadas para afinidade de ligação, bioliza, ressonância plasmon superficial, calorimetria de titulação isoterina, phorometria bioleride, termoforese de microescala ou gradiente de composição, dispersão de luz multi-ângulo. A estrutura proteica pode ser determinada por cristalografia de raios-X, miscroscopia crio-elétron, ou RN.