Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

SEC-MALS är en kvantitativ metod för att bestämma molekylvikt, storlek och konformation av makromolekyler i lösning. Det kan identifiera oligomerer och komplex, och karakterisera svåra prover, som glykoproteiner och membranproteiner. SEC-MALS är en absolut metod.

Den bygger på grundläggande fysik, och är inte beroende av samarbete mot molekylära standarder, molekylens konformation, eller hur vi interagerar med separationsmediet. SEC-MALS kan tillämpas på många system som är åtskilda av sek. Från peptider och små polymerer till proteiner, nukleokapslar, polysackarider, syntetiska polymerer, virusliknande partiklar, och små virus.

Det är viktigt att kontrollera att ditt system och buffertar missar leverantörens rekommendationer för lågt partikelinnehåll. Rådgör med leverantörens tekniska supportrepresentant för att vara säker. Påbörja den här proceduren med beredning av SEC-MALS-systemet enligt beskrivningen i textprotokollet.

Med hjälp av varje REAgens av PLC-kvalitet bereder du en liter fosfatbuffrad saltlösning med 50 till 100 millimolarnatriumklorid. Filtrera bufferten till 0,1 mikron med hjälp av ett buteljerat upp polyetercellsskumfilter, eller liknande. Filtrera de första 50 till 100 milliliter bufferten till en avfallsflaska för att eliminera partiklarna från de torra filtren.

Filtrera sedan resten till en ren, steril flaska som tidigare har tvättats med filtrerat, avjoniserat vatten och hålls för att förhindra att damm kommer in. Spola kolonnen över natten med en flödeshastighet på 0,5 milliliter per minut för att jämviktskolonn i bufferten och för att avlägsna partiklar. Använd FPLC:s kontinuerliga flödesläge och se till att flödet inte stannar förrän alla SEC-MALS-körningar är klara.

Placera DRI-flödescellen i utrensningsläge under över nattens flush. När du börjar spola, gradvis ramp flödet för att förhindra kolonnen sprider effekt, orsakas av en plötslig förändring av trycket i kolumnen. Stäng av utrensningen innan provkörningar påbörjas.

Kontrollera systemets renlighet genom att lätt knacka på slangen nedströms av kolonnen för att frigöra ackumulerade partiklar. Observera signalen i 90 graders detektor på frontpanelens display av MALS-instrumentet. Kontrollera att topp-till-topp-bruset är högst 50-100 mikrovolt.

Kontrollera också att brytningsindex, eller RI-signal, är stabil till mindre än 1 gånger tio till minus sju brytningsindexenheterna. Utför en blindinjektion för att verifiera att injektorn är ren från partiklar. Ett blankt är helt enkelt den löpande bufferten som bereds i en färsk, steril injektionsflaska.

Om partikeltoppen är högst en milliliter i volym, och inte mer än fem millivolt över baslinjen, då är systemet redo för prover. Annars, utför ytterligare tomma injektioner tills ren, eller utföra underhåll för att rengöra injektorn. Nu, förbereda minst 200 mikroliter av BSA på en till två milligram per milliliter i SCC buffert.

Filtrera proteinet till 02 mikrometer, med hjälp av ett sprutat spetsfilter. Kassera de första dropparna av filtrate, för att eliminera partiklar från de torra filtren. Alternativt centrifug provet vid 10, 000 gånger G i femton minuter för att möjliggöra utfällning av icke-lösliga aggregat och andra stora partiklar.

Injicera sedan 100 mikroliter av BSA-lösningen i slingan. Öppna nytt experiment från metod i MALS programvara menyn. Välj sedan onlinemetoden från mappen light scattering system methods.

Om en DLS-detektor finns väljer du online-metoden från ljusspridningen med QELS-mappen. Ange parametrar för prov- och mobilfasen i konfigurationsavsnittet. I den generiska pumpvyn ställer du in flödet till det som används i FPLC.

Sedan navigerar du till den generiska pumpvyn, förgreningen lösningsmedel, namnfältet och väljer PBS. I injektorvyn, provgren, ange namnet som BSA. Ställ in DN/DC till 0,185, ställ in A2 till 0 och ställ in UV-utdöendekoefficienten på 0,667 milliliter per milligramcentimeter.

I avsnittet procedurer, grundläggande samlingsvy, välj kryssrutan utlösaren på auto-injicera. Ange varaktigheten för körningen till 70 minuter, så att data samlas in för hela anspelningen, tills den totala permeationsvolymen för SEK-kolumnen har uppnåtts. Starta experimentet i MALS-programvaran genom att klicka på körknappen.

Den kommer att börja läsa data efter att ha fått pulssignalen från FPLC-instrumentet via MALS-detektorn. Nollställ DRI-signalen genom att klicka på auto-noll-knappen på instrumentets frontpanel. Arbeta i FPLC-programvaran, navigera till manuell, exekvera manuella instruktioner, ange märke och infoga namnet på proteinet och körningen.

Växla insprutningsventilen från manuell belastning för att under flödesväg injicera injektionsventil. Inkludera en pulssignal genom att sätta in en 0,5 sekunders puls under IO-boxens digitala ut. Detta kommer att utlösa datainsamling i MALS-programvaran.

Injicera nu provet i slingan. Klicka på execute i FPLC-programvaran för att starta experimentkörningen. Utför analys steg för steg, under avsnittet procedurer i MALS-programvaran.

Verifiera att toppar visas vid ungefär samma allusionvolym i UV, MALS och RI genom att kontrollera den grundläggande insamlingsvyn. I baslinjevyn definierar du baslinjen för alla signaler. I vyn toppar definierar du de toppar som ska analyseras genom att klicka och dra musen.

Välj den centrala 50%av varje topp. Välj först monomertopp och sedan den dimer peak. Under varje topp, verifiera de korrekta värdena för dn/dc och extinktionskoefficient vid 280 nanometer för BSA.

I procedurerna, justeringsvyn, markerar du den centrala regionen i topparna genom att klicka och dra musen. Klicka på justera signaler, och sedan okej. I förfarandena, band breddning uppfattning, välja den centrala 50%av monomer topp.

Kontrollera att brytningsindexdetektorn anges som referensinstrument. Klicka sedan på utför passform, och tillämpa för att matcha UV och ljus spridningssignaler till brytningsindex signalen. Zooma in i topparna för att kontrollera att de överlappar varandra mycket nära inom de centrala 50 till 70%och klicka sedan på okej.

I procedurerna, normaliseringsvyn, väljer du topp ett. Ange 3,0 nanometer som RG-värde, klicka på normalisera och klicka sedan på okej. Visa grafen över resultaten i EASI-grafvyn.

Välj molmassa från displayen släppa ner längst upp i fönstret. Använd kontroll, klicka och dra för att zooma in i toppregionen. Om du vill visa de slutliga tabulerade viktgenomsnittet molar massa resultat för monomer och dimer toppar, navigera till topp resultat, molar massa stunder, MW, och välja till resultaten, rapportsammanfattning.

Renhet rapporteras under toppresultat, massa fraktion. På arkivmenyn väljer du Spara som metod, och sparar de analyserade BSA-data som en standardmetod för framtida mätningar av alla typer av proteiner. Normaliseringen och bandet breddning parametrar som fastställts för BSA kommer att föras över i analysen.

Visas här är SEC-MALS analyser av BSA, med hjälp av en 200 Ångström porstorlek uteslutning kolumn. Kromatogram spår normaliseras till monomer topp, och offset för tydlighetens skull. Vanliga artefakter som kan ignoreras påpekas, inklusive en partikeltopp nära början av ljusspridningssignalen, samt salt och upplösta lufttoppar nära den totala permeationsvolymen i brytningsindexsignalen.

Kromatogrammet uppvisar utmärkt monomer-dimer-trimer separation, och ljusspridning signal uppvisar hög signal till buller. Den monomer och dimer vikt genomsnittliga molar massa värden uppvisar hög homogenitet. Här är exempel på LÅG KVALITET SEC-MALS analyser.

I det här exemplet resulterar otillräcklig separation på en 75 Ångström porstorlek uteslutning kolumn i en partikel topp mellan åtta till nio minuter, som inte är väl åtskilda från proteinerna. Här finns det en otillräcklig signal till brusförhållande, och omfattande partiklar i anslutning till proteinerna är uppenbara i ljusspridningssignalen. Nycklarna till bra SEC-MALS resultat är att välja en lämplig kolumn, se till att systemet är kalibrerad med svagt ljus spridning buller, och pre-filtrering eller centrifugering proverna för att ta bort partiklar.

Efter SEC-MALS, protein prover kan analyseras ytterligare för bindande affinitet, bioliza, yta plasmon resonans, isotermisk titrering calorimetry, biolerid phorometry, mikroskala thermophoresis, eller sammansättning gradient, multi-vinkel ljusspridning. Proteinstrukturen kan bestämmas genom röntgenkristallografi, kryo-elektronfelkollering, eller NMR.