Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

نود أن نشكر النواة LJI تدفق الCytometry للمساعدة في إجراء قياس السيل الشامل. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01HL134236، P01HL136275، و R01CA202987 (جميعها إلى C.C.H) و ADA7-12-MN-31 (04) (إلى C.C.H. و Y.P.Z).

اتبعت جميع التجارب المبادئ التوجيهية المعتمدة من معهد لا جولا للحساسية والمناعة لجنة رعاية الحيوانات واستخدام، وتم الحصول على الموافقة على استخدام القوارض من معهد لا جولا للحساسية والمناعة وفقا للمعايير المبينة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة.
<p cl...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

في العقود الماضية، تم استخدام الفلورية القائمة على الخلايا تدفق كوسيلة رئيسية لدراسة السلالات الخلوية والتباين1،2،3. وعلى الرغم من أن قياس التدفق السيتومتري قد وفر بيانات متعددة الأبعاد، فإن هذه الطريقة محدودة بخيارات البارامترات والتد...

في العقود القليلة الماضية، كانت أساليب القياس السيتومي أداة قوية للتحقيق في نظام المكون ة في BM. وتشمل هذه الأساليب الفلورسنت تنشيط تدفق السيل والطريقة الجديدة من CyTOF باستخدام الأجسام المضادة الثقيلة التي تحمل علامات المعادن. وقد أدت إلى اكتشافات العديد من أنواع الخلايا في عينة بيولوجية غير متجانسة عن طريق تحديد ملامح التعبير فريدة من نوعها علامة السطح. يؤدي تداخل الطيف المتزايد المرتبط بالمزيد من القنوات إلى عدم دقة البيانات في تطبيقات قياس الدفق الفلوري. لذلك، تتم إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بشكل روتيني من أجل إثراء مجموعات الخلايا ذات الأهمية لتحليل الخلايا المتدفقة المنشط الفلورسنت. على سبيل المثال، تعتبر Ly6G (أو Gr-1) و CD11b علامات الخلايا النخاعية الناضجة وLy6G+ (أو Gr-1+) وCD11b+ الخلايا تتم إزالتها بشكل روتيني من عينات BM باستخدام مجموعات التخصيب المغناطيسي قبل تحليل الخلايا المتدفقة من الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (HSPCs) أو من خلال الجمع بين هذه العلامات في قناة واحدة تفريغ كوكتيل1،2،3. مثال آخر هو أن العدلات تتم إزالتها بشكل روتيني من عينة الدم البشري لإثراء خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMC) للدراسات المناعية. نخاع العظم كله معزولة عن الماوس أو الإنسان، ومع ذلك، نادرا ما يتم التحقيق سليمة لتحليل الخلايا.
في الآونة الأخيرة، أصبح CyTOF أداة ثورية للتحقيق في نظام المكونة للدم4،5،6. مع CyTOF، يتم استبدال الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلوروفور بالأجسام المضادة الثقيلة التي تحمل اسم المراسل. وتتيح هذه الطريقة قياس أكثر من 40 علامة في آن واحد دون الاهتمام بتداخل الطيف. وقد مكّن ذلك من تحليل العينة البيولوجية السليمة دون خطوات ما قبل الاستنفاد أو قناة تفريغ. ولذلك، يمكننا أن نرى نظام المكونة للدم بشكل شامل مع الأبعاد عالية المحتوى من التقليدية 2-D مخطط الانسيابية. يمكن الآن جلب مجموعات الخلايا التي تم حذفها في الماضي أثناء عملية الاستنفاد أو الضخ إلى النور مع البيانات عالية الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة CyTOF4،5. لقد صممنا لوحة الأجسام المضادة التي تقيس في وقت واحد 39 المعلمات في نظام المكونة للدم مع التركيز على linage النخاعي7. بالمقارنة مع البيانات التقليدية للتدفق الخلوي، فإن تفسير وتصور البيانات عالية الأبعاد غير المسبوقة أحادية الخلية التي تولدها CyTOF أمر صعب. وقد طور العلماء الحسابية تقنيات الحد من البعد من أجل تصور مجموعات البيانات عالية الأبعاد. في هذه المقالة، استخدمنا الخوارزمية، viSNE، والتي تستخدم تقنية T-توزيع الجار الاستوتشاستيك (t-SNE) لتحليل بيانات CyTOF وتقديم نتيجة عالية الأبعاد على خريطة ثنائية الأبعاد مع الحفاظ على بنية عالية الأبعاد من البيانات8،9،10. على مؤامرة tSNE، يتم تجميع خلايا مماثلة في مجموعات فرعية ويتم استخدام اللون لتمييز ميزة الخلايا. على سبيل المثال، في الشكل 1 يتم توزيع الخلايا النخاعية في عدة مجموعات فرعية الخلية على أساس أوجه التشابه من أنماط التعبير عن 33 علامات السطح الناجمة عن CyTOF (الشكل 1)4. هنا نحن التحقيق نخاع عظم الماوس مع لدينا ذكرت سابقا 39-علامة لوحة CyTOF بواسطة تحليل viSNE7. كشف تحليل viSNE لبيانات نا سيف عن مجموعة خلايا غير محددة أظهرت كلا HSPC (CD117+) والعدلات (Ly6G+) خصائص (الشكل 2)7.
في الختام، نقدم بروتوكولا لمعالجة نخاع العظم كله الطازجة لتحليل CyTOF. في هذه المقالة، استخدمنا نخاع عظم الفأر كمثال، في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا لمعالجة عينات نخاع العظم البشري. كما أن التفاصيل الخاصة بعينات نخاع العظم البشري مذكورة في البروتوكول أيضاً. ميزة هذا البروتوكول هو أنه يحتوي على تفاصيل مثل وقت الحضانة ودرجة الحرارة التي تم تحسينها للحفاظ على خلايا العدلة النسب في نخاع العظام كله لتمكين التحقيق على نخاع العظام كله سليمة. ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتطبيقات قياس الدفق الفلوري.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

في هذه المقالة، نقدم بروتوكول احسن للحفاظ على الخلايا العدلية النسب في BM الطازجة لتحليل كامل BM CyTOF. لقد استخدمنا لوحة ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد للأجسام المضادة ثلاثية الأبعاد لتقييم نظام الخلايا الدموية مع التركيز على خلايا العدلات السلالة باستخدام هذا البروتوكول. تم تحليل نتيجة CyTOF مع خوارزمية الحد من الأبعاد مفتوحة المورد، viSNE، وقدمت البيانات لإظهار نتيجة هذا البروتوكول. لقد اكتشفنا مجموعات خلايا جديدة على أساس هذا البروتوكول. هذا البروتوكول من إعداد BM كاملة جديدة يمكن استخدامها ل1)، وتحليل CyTOF لاكتشاف مجموعات الخلايا غير معروف من BM كله، 2)، والتحقيق في عيوب BM كاملة للمرضى الذين يعانون من اضطرابات الدم مثل سرطان الدم، 3)، والمساعدة في تحسين الفلورسنت تنشيط تدفق البروتوكولات السيتوميالتي تستخدم BM كامل الطازجة.

الشكل 1 هو عرض كمثال على ذلك من تجارب CyTOF. على هذه المؤامرة tSNE تم تجميع الخلايا عبر أنسجة الماوس متعددة في مجموعات فرعية استناداً إلى تشابه ملامح التعبير علامة السطح قياسها بواسطة لوحة CyTOF 33 معلمة. تم تجميع الخلايا ذات الخصائص المشابهة بشكل تلقائي معًا مثل العدلات أو الضامة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

هنا، نقدم بروتوكول لمعالجة نخاع العظم الطازج (BM) معزولة عن الماوس أو الإنسان لالكتلة عالية الأبعاد الخلايا (الخلايا من قبل وقت الرحلة، CyTOF) تحليل الخلايا العدلية النسب.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

هذا البروتوكول تحليل الخلايا الشامل يحافظ على سلامة نخاع العظام كله، مما يسمح إنقاذ المعلومات التي فقدت أثناء إعداد العينة التقليدية لتحليل الخلايا تحت درس. هذا البروتوكول السريع وغير جهد عزل نخاع العظام يسهل الحصول على مجموعات الخلايا النخاعية غير قابلة للحياة قابلة للحياة مثل المجموعات الفرعية نادرة العدلات النسب. استخدام قياس الخلايا الشامل لتحديد سابقا تحت تقدير الخلايا المناعية مثل خلايا النسب العدلات قد يكون لها آثار واسعة لمجموعة واسعة من الأمراض.يحافظ هذا البروتوكول على سلامة الخلايا النخاعية القصيرة التي تعيش في نخاع العظم ويمكن تطبيقها بسهولة على أنواع الأنسجة الأخرى مثل الورم الصلب. نحن تبسيط بروتوكول لجعله سهل الاستعمال قدر الإمكان، ولكن كما هو الحال في جميع الدراسات البيولوجية قد تحتاج إلى عدد قليل من الممارسة يدير لإدارة. عندما تفعل هذا في المرة الأولى، يمكنك الحصول على جميع الكواشف الخاصة بك جاهزة أولاً ومن ثم تتبع بدقة البروتوكول.إذا واجهت أي مشاكل، يمكنك الاتصال بـ CyTOForum والتحدث مع مستخدمي CyTOF الآخرين الذين يمكنهم المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. لإعداد العينة البيولوجية، يمكن أن تحدث الحيل البسيطة فرقا كبيرا مع النتيجة النهائية. العرض التوضيحي المرئي أسهل بكثير بالنسبة للمستخدم الجديد لفهم البروتوكول.إذا كنت تفعل هذا للمرة الأولى، يمكنك الحصول على الكواشف الخاصة بك جاهزة أولاً ثم اتبع بدقة البروتوكول. لحصاد نخاع العظم، ضع ستة إلى 10 أسابيع من العمر C57 أسود ستة ماوس في موقف supine على وسادة جراحية معقمة واستخدام 70٪ الإيثانول لتعقيم البطن والأطراف الخلفية. استخدمي مقص جراحيّ لتشريحه لفتح تجويف البطن وإزالة الجلد لفضح الأطراف الخلفية.باستخدام زوج من ملقط خلع الملابس تيب حادة، عقد الساق الماوس الحق تحت الكاحل واستخدام زوج من ملقط خلع الملابس المنحنية لتحقيق الاستقرار في الساق تحت ملقط خلع الملابس ة هاب حادة. استخدام ملقط خلع الملابس مقلوب حادة لكسر الساق وإزالة العضلات لفضح العظام. قبل وضع الساق في PBS الباردة، نقل ملقط خلع الملابس المنحنية الاستقرار إلى عظم الفخذ وشريحة ملقط خلع الملابس حادة يميل تحت مفصل الركبة لعقد الركبة.سحب بلطف ما يصل إلى خلع الركبة وإزالة العضلات من الركبة لفضح عظم الفخذ. عقد عظم الفخذ المكشوفة من قبل ملقط خلع الملابس المنحنية واستخدام مقص الجراحية لقطع عظم الفخذ من الجزء السفلي من العظام. ثم ضع عظم الفخذ في برنامج تلفزيوني.بعد ذلك، استخدم إبرة قياس 18 لكمة ثقب في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 0.5 ملليلتر ووضع كل من العظام في الأنبوب مع الأطراف المفتوحة للعظام التي تواجه الهبوط في الحفرة. ضع أنبوب 0.5 ملليلتر في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.7 ملليلتر وتدور الأنابيب ذات الطبقات المزدوجة في جهاز طرد مركزي صغير. في نهاية الطرد المركزي، تأكد من أن نخاع العظم قد تم استخراجه إلى أسفل الأنبوب.لطخة خلايا نخاع العظام لعملية استئصال الخلايا الشامل, إعادة تعليق نخاع العظم في ملليلتر واحد من خلايا الدم الحمراء العازلة تحلل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. تصفية الخلايا من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وغسل الخلايا مع تسعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد، الباردة.إعادة تعليق بيليه خلية نخاع العظام في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد, الباردة لحساب ونقل خمس مرات 10 إلى aliquot الخلية السادسة في أنبوب جديد 15 ملليلتر. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من كتلة الخلايا التلطخ العازلة، تستكمل مع 125 سيسبلاتين نانومولار. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا في أربعة ملليلتر من عازلة استئصال الخلايا الكتلة الطازجة.إعادة تعليق بيليه في 50 microliters من FC مستقبلات حظر الحل. بعد 10 دقائق في أربع درجات مئوية، إضافة 50 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة من الفائدة إلى الخلايا ولأنابيب بلطف لخلط. درجة الحرارة في مختلف خطوات الحضانة هي مهمة جدا في الحفاظ على صلاحية خلايا نخاع العظام.بعد 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، وغسل الخلايا مرتين في مليلترين من كتلة جديدة عازلة قياس الخلايا في غسل قبل إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من إعداد حديثا 1.6٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من عازلة بيرم ثابت تكملها 125 حل التشابك نانوموللار لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. قبل تحليل الخلايا عن طريق قياس الخلايا الشامل، دوامة بلطف والطرد المركزي تعليق الخلية قبل غسل الخلايا في مليلتر اثنين من خلايا الخلايا الطازجة التلطخ العازلة.بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين في ملليلتر واحد من الماء المقطر لكل غسل، وpirating بعناية عظمى بعد الغسيل الثاني قبل إعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من تركيز العازلة قياس الخلايا الشامل لتحليل القياسات الخلايا الشامل. في هذا T موزعة مؤامرة تضمين الجار العشوائي، والخلايا عبر أنسجة الماوس متعددة كانت مجمعة في مجموعات فرعية استنادا إلى التشابه من ملامحها تعبير علامة سطح كما تقاس من قبل 33 معلمة لوحة القياسات الحرارية الشامل. الخلايا ذات الخصائص الأكثر تشابهًا تم تجميعها تلقائيًا معًا استنادًا إلى التعبير عن هذه العلامات على كل خلية.باستخدام هذه الطريقة، تم الحفاظ على سلامة نخاع العظام كله، مما أدى إلى اكتشاف سكان الخلايا غير معروف سابقا أن في وقت واحد يشارك في تعبير العدلات وtemmatopoietic الجذعية والخلايا السلف علامات سطح التوقيع. هذا العدد من الخلايا، التي تم حذفها سابقا في الدراسات السلف النخاعي، بسبب استنفاد الخلايا الإيجابية Ly6G، معارض نمط متميز من التعبير علامة السطح. والأهم من ذلك، أدت هذه البيانات إلى اكتشاف مجموعة فرعية صغيرة من مجموعة الخلايا الإيجابية Ly6G التي لا تعبر عن Ly6G، ولكن تم تجميعها بشكل وثيق مع الخلايا الإيجابية Ly6G Ly6G الإيجابية CD117، مما يشير إلى تشابه هذه الخلايا مع نسب العدلات استنادًا إلى التعبير عن علامات السطح 33 المستخدمة في هذه التجربة العملية cycytometry.ويمكن بناء لوحة فرز الخلايا المنشطة 13 لونًا، مما يسمح بعزل أسبقية العدلات عن طريق قياس التدفق الخلوي للمقايس الوظيفية المصب. من المهم إجراء عملية عزل نخاع العظم في أسرع وقت ممكن والحفاظ على الخلايا عند أربع درجات مئوية أثناء إجراء التلطخ.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

التحقيق في الاستقطاب البلاعم عن طريق نخاع العظم الضامة المشتقة

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...