Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Vi vil gerne takke lji flow flowcytometri kerne for hjælp med masse cytometri procedure. Dette arbejde blev støttet af NIH Grants R01HL134236, P01HL136275 og R01CA202987 (alle til C. C. H) og ADA7-12-MN-31 (04) (til C.C.H. og Y. P. Z).

Alle eksperimenter fulgte godkendte retningslinjer fra La Jolla Institut for allergi og immunologisk dyrepleje-og Brugsudvalg, og godkendelse af brugen af gnavere blev indhentet fra La Jolla Institute for allergi og Immunologi efter kriterier, der er skitseret i Vejledning til pleje og brug af forsøgsdyr fra de nationale sundhedsinstitutter.
1. høst mus knoglemarv (BM)
<ol><li>Køb C57BL/6J-mus fra en kommerciel leverandør. Fodre standard gnaver Chow kost og hus i mikroisolator bure i en ...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

I de seneste årtier, fluorescens-baserede flow cytometri blev anvendt som den vigtigste metode til at studere cellulære slægter og heterogenitet1,2,3. Selvom flow cytometri har givet flerdimensionelle data, er denne metode begrænset af valg af parametre og spektral overlap. For at overvinde den svage flow cytometri udnyttede vi CyTOF, som bruger tungmetaller isotoper i stedet for fluorophores til at mærke antistoffer, der e...

I de sidste par årtier, cytometri metoder har været et effektivt redskab til at undersøge det hæmatopoietiske system i BM. Disse metoder omfatter fluorescens-aktiveret flow cytometri og den nye metode til CyTOF ved hjælp af heavy metal-mærkede antistoffer. De har ført til opdagelser af mange celletyper i en heterogen biologisk prøve ved identifikation af deres unikke overflade markør udtryks profiler. Øget spektrum overlapninger, der er forbundet med flere kanaler fører til højere data unøjagtighed i fluorescens-aktiverede flow cytometri applikationer. Derfor fjernes uønskede celler rutinemæssigt for at berige cellepopulationer af interesse for fluorescens-aktiverede flow cytometri analyse. For eksempel, Ly6G (eller gr-1) og CD11b betragtes modne myeloid celle markører og Ly6G+ (eller gr-1+) og CD11b+ celler rutinemæssigt fjernes fra BM prøver ved hjælp af magnetisk berigelse kits før flow cytometri analyse af hæmatopoietisk stilk og progenitorceller (hspc'er) eller ved at kombinere disse markører i en dump cocktail Channel1,2,3. Et andet eksempel er, at neutrofiler rutinemæssigt fjernes fra humant blodprøve for at berige perifert blod mononukleære celler (PBMC) til immunologiske undersøgelser. Hele knoglemarv isoleret fra mus eller menneske, dog, er sjældent undersøgt intakt for cytometri analyse.
For nylig er cytof blevet et revolutionerende værktøj til at undersøge det hæmatopoietiske system4,5,6. Med CyTOF erstattes de fluorofore-mærkede antistoffer af tunge element reporter-mærkede antistoffer. Denne metode giver mulighed for måling af over 40 markører samtidig uden bekymring for spektrum overlap. Det har gjort det muligt at analysere intakt biologisk prøvemateriale uden præ-depletering trin eller en dump kanal. Derfor kan vi se det hæmatopoietiske system omfattende med højt indhold dimensionalitet fra konventionelle 2-D flow cytometri plots. Cellepopulationer, der tidligere er udeladt under nedbrydningen eller gating-processen, kan nu bringes i lys med de højdimensionelle data genereret af cytof4,5. Vi har designet et antistof panel, der samtidig måler 39 parametre i det hæmatopoietiske system med fokus på myeloid Linage7. Sammenlignet med de konventionelle flow cytometri data, er fortolkningen og visualiseringen af de hidtil usete encellehøjdimensionelle data genereret af CyTOF udfordrende. Computational forskere har udviklet dimensionalitet reduktionsteknikker til visualisering af High-dimensionelle datasæt. I denne artikel, vi brugte algoritmen, viSNE, som bruger t-Distributed Stochastic nabo Embedding (t-SNE) teknik til at analysere CyTOF data og til at præsentere det høje-dimensionelle resultat på en 2-dimensionelle kort samtidig bevare den høje-dimensionelle struktur af data8,9,10. På tSNE-plottet grupperes lignende celler i undersæt, og farven bruges til at fremhæve cellens funktion. For eksempel, på figur 1 de myeloide celler fordeles i flere celle undergrupper baseret på lighederne i deres udtryks mønstre af 33 overflade markører skyldes cytof (figur 1)4. Her undersøgte vi musens knoglemarv med vores tidligere rapporterede 39-markør CyTOF-panel af viSNE-analyse7. viSNE-analysen af vores CyTOF-data afslørede en uidentificeret cellepopulation, der viste både HSPC (CD117+) og neutrofile (Ly6G+) karakteristika (figur 2)7.
Afslutningsvis præsenterer vi en protokol til at behandle frisk hele knoglemarv til CyTOF analyse. I denne artikel, vi brugte mus knoglemarv som et eksempel, mens denne protokol også kan bruges til at behandle menneskelige knoglemarvsprøver. De oplysninger, der er specifikke for humane knoglemarvsprøver er også noteret i protokollen så godt. Fordelen ved denne protokol er, at den indeholder detaljer såsom inkubationstid og temperatur, der blev optimeret for at bevare neutrofillineceller i hele knoglemarven for at muliggøre undersøgelse af den intakte hel knoglemarv. Denne protokol kan også let ændres for fluorescens-aktiverede flow cytometri applikationer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

I denne artikel præsenterer vi en protokol, der er optimeret til at bevare neutrofile-Lineage celler i frisk BM for hele BM CyTOF analyse. Vi udnyttede en myeloid-partisk 39-antistof CyTOF panel til at evaluere det hæmatopoietiske system med fokus på neutrofile-Lineage celler ved hjælp af denne protokol. CyTOF-resultatet blev analyseret med en dimensional reduktions algoritme med åben ressource, viSNE, og dataene blev præsenteret for at demonstrere resultatet af denne protokol. Vi har opdaget nye neutrofile-Lineage cellepopulationer baseret på denne protokol. Denne protokol af friske hele BM præparat kan anvendes til 1), CyTOF analyse at opdage uidentificerede cellepopulationer fra hele BM, 2), undersøge hele BM defekter for patienter med blodsygdomme såsom leukæmi, 3), bistå optimering af Fluorescens-aktiverede flow cytometri protokoller, der udnytter frisk hele BM.

Figur 1 er et eksempel på resultaterne af cytof-forsøgene. På dette tSNE plot cellerne på tværs af flere muse væv blev grupperet i undersæt baseret på ligheden mellem deres overflade markør udtryks profiler målt ved en 33-parameter CyTOF panel. Celler med flere lignende egenskaber blev automatisk grupperet sammen, såsom neutrofiler, makrofager eller DCs baseret på udtrykket af 33-mærkerne på hver celle.
Figur 2 er præse...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler

Her præsenterer vi en protokol til at behandle frisk knoglemarv (BM) isoleret fra mus eller human for high-dimensionelle masse cytometri (flowcytometri af Time-of-Flight, cytof) analyse af neutrofile-Lineage celler.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Denne massecytometriprotokol bevarer hele knoglemarvens integritet og gør det muligt at redde de oplysninger, der gik tabt under konventionel prøvepræparation til analyse af underundersøgte celler. Denne hurtige og ubesværet knoglemarvsisolering protokol letter erhvervelsen af levedygtige kortlivede myeloid celle populationer såsom sjældne neutrofile-afstamning delmængder. Brug masse cytometri til at identificere tidligere under værdsat immunceller såsom neutrofile-afstamning celler kan have brede konsekvenser for en bred vifte af sygdomme.Denne protokol bevarer integriteten af de kortlivede myeloidceller, der er til stede i knoglemarven og let kan anvendes på andre vævstyper såsom den faste tumor. Vi forenklede til protokol for at gøre det så brugervenligt som muligt, men som i alle biologiske undersøgelser kan det være nødvendigt med et par praksis kører til at styre. Når du gør dette første gang, kan du få alle dine reagenser klar først og derefter nøje følge protokollen.Hvis du oplever problemer, kan du oprette forbindelse til CyTOForum og tale med andre CyTOF-brugere, der kan hjælpe med at foretage fejlfinding. For biologisk prøve forberedelse, kan enkle tricks gøre en enorm forskel med slutresultatet. En visuel demonstration er meget lettere for en ny bruger at forstå protokollen.Hvis du gør dette for første gang, kan du få dine reagenser klar først og derefter nøje følge protokollen. For knoglemarvshøst, placere en seks til 10 uger gammel C57 sort seks mus i liggende position på en steril kirurgisk pad og bruge 70% ethanol til at sterilisere maven og bag lemmer. Brug et par dissekere kirurgisk saks til at åbne bughulen og fjerne huden til at udsætte bagbenene.Ved hjælp af et par stumpe tippet dressing kraftforhold, holde musen skinneben lige under anklen og bruge et par buede dressing kraftforbånd til at stabilisere skinnebenet under stumpe tippet dressing kraftforhold. Brug den stumpe tippet dressing kraftforriver til at bryde skinnebenet og fjerne musklen til at udsætte knoglen. Før skinnebenet anbringes i koldt PBS, skal du flytte de stabiliserende buede forbindingsforrædere til lårbenet og skubbe de stumpe tippede forbindingsforbånd under knæleddet for at holde knæskallen.Træk forsigtigt op for at forskyde knæskallen og fjerne musklen fra knæskallen for at afsløre lårbenet. Hold den eksponerede lårben ved den buede dressing kraftforbånd og bruge kirurgisk saks til at skære lårbenet fra bunden af knoglen. Placer derefter lårbenet i PBS.Brug derefter en 18 gauge nål til at slå et hul i et 0,5 milliliter mikrocentrifuge rør og placere begge knogler i røret med de åbne ender af knoglerne vender nedad i hullet. 0,5 milliliterrøret anbringes i et mikrocentrifugerør på 1,7 milliliter, og de dobbelt lagdelte rør drejes i en mikrocentrifuge. Ved afslutningen af centrifugering, bekræfte, at knoglemarven er blevet ekstraheret til bunden af røret.At plette knoglemarvsceller for masse cytometri, re suspendere knoglemarven i en milliliter røde blodlegemer lysis buffer i 10 minutter ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning opsamler cellerne ved centrifugering, og pelletsen suspenderes igen i en milliliter kold PBS. Cellerne filtreres gennem en 70 mikrometers si i et konisk rør på 15 milliliter, og cellerne vaskes med ni milliliter frisk, kold PBS.Ophæng knoglemarvscellepilpellen igen i 10 milliliter frisk, kold PBS til optælling og overfør en fem gange 10 til den sjette celle aliquot i et nyt 15 milliliterrør. Cellerne opsamls ved centrifugering, og cellerne suspenderes igen i en milliliter massecytometrifarvningsbuffer suppleret med 125 nanomolarcisplatin. Efter fem minutter ved stuetemperatur vaskes cellerne i fire milliliter frisk massecytometribuffer.Pelleten suspenderes igen i 50 mikroliter af FC-receptorblokeringsopløsning. Efter 10 minutter ved fire grader Celsius, tilsæt 50 mikroliter af antistof cocktail af interesse for cellerne og forsigtigt pipet til at blande. Temperaturen i forskellige inkubationstrin er meget vigtige for at bevare levedygtigheden af knoglemarvscellerne.Efter 30 minutter ved fire grader Celsius vaskes cellerne to gange i to milliliter frisk massecytometribuffer pr. vask, før cellerne suspenderes igen i en milliliter frisklavet 1,6% formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning indsamles cellerne ved centrifugering, og pelleten suspenderes igen i en milliliter fast perm buffer suppleret med 125 nanomolar intercalation opløsning til en overnight inkubation ved fire grader Celsius. Før cellerne analyseres ved massecytometri, vortex og centrifuge cellesuspensionen, før cellerne vaskes i to milliliter frisk massecytometrifarvningsbuffer.Dernæst vaskes cellerne to gange i en milliliter destilleret vand pr. vask, og supernatanten aspireres forsigtigt efter den anden vask, før cellerne suspenderes én gang 10 til den sjette celle pr. milliliter massecytometribufferkoncentration til massecytometrianalyse. I denne T distribueret stokastiske nabo indlejring plot, cellerne på tværs af flere musevæv blev grupperet i delmængder baseret på ligheden af deres overflade markør udtryk profiler målt ved en 33 parameter masse cytometri panel. Celler med mere lignende egenskaber blev automatisk grupperet sammen baseret på udtrykket af disse mærker på hver celle.Ved hjælp af denne metode blev hele knoglemarvens integritet bevaret, hvilket førte til opdagelsen af en hidtil ukendt cellepopulation, der samtidig co-udtrykker neutrofil og hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller signatur overflademarkører. Denne cellepopulation, som tidligere blev udeladt i myeloid progenitor undersøgelser, på grund af Ly6G positiv celle udtynding, udviser et særskilt mønster af overflade markør udtryk. Endnu vigtigere, disse data førte til opdagelsen af en lille delmængde af Ly6G positive celle klynge, der ikke udtrykker Ly6G, men blev grupperet tæt til CD117 positive Ly6G positive celler, hvilket tyder på ligheden mellem disse celler til neutrofile-afstamning baseret på udtrykket af de 33 overflade markører, der anvendes i denne masse cytometri eksperiment.En 13 farve florescence aktiveret celle sortering panel kunne derefter bygges, så isolering af neutrofile stamfader ved flow cytometri for downstream funktionelle analyser. Det er vigtigt at udføre knoglemarvsisolationsproceduren så hurtigt som muligt og holde cellerne på fire grader Celsius under farvningsproceduren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Undersøgelse af Makrofag Polarization Brug knoglemarvsafledte makrofager

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-afledt Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral transduktion af knoglemarven til at generere T-celle receptor Retrogenic Mus

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktiveret cellesortering til oprensning af Plasmacytoide dendritiske celler fra knoglemarven i mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Enkelt-celle analyse af Immunophenotype og cytokin produktion i perifere blod via masse flowcytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering af humane monocyt delmængder af fuldblod Flow flowcytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...