Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

We willen graag de LJI flow Cytometry core bedanken voor hulp bij de massa Cytometry procedure. Dit werk werd gesteund door NIH verleent R01HL134236, P01HL136275, en R01CA202987 (allen aan C. C. H) en ADA7-12-MN-31 (04) (aan C.C.H. en Y. P. Z).

Alle experimenten volgden goedgekeurde richtlijnen van het Instituut van La Jolla voor allergie en immunologie de dierlijke zorg en het gebruiks Comité, en de goedkeuring voor het gebruik van knaagdieren werden verkregen van het Instituut van La Jolla voor allergie en immunologie volgens criteria die in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de nationale gezondheidsinstituten.
1. het beenmerg van de oogstmuis (BM)
<ol><li>Koop C57BL/6J muizen van een commerciële leve...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

In de afgelopen decennia, fluorescentie-based flow Cytometry werd gebruikt als de belangrijkste methode om cellulaire lineages en heterogeniteit1,2,3studie. Hoewel flow Cytometry heeft multi-dimensionale gegevens, deze methode is beperkt door keuzes van parameters en spectrale overlap. Om de zwakheid van Stroom Cytometry te overwinnen namen wij voordeel van CyTOF, die zware metaal isotopen in plaats van fluorophores gebruikt om ...

In de afgelopen decennia, Cytometry methoden zijn een krachtig instrument om het hematopoietische systeem te onderzoeken in de BM. Deze methodes omvatten fluorescentie-geactiveerde Stroom Cytometry en de nieuwe methode van CyTOF gebruikend zware metaal-geëtiketteerde antilichamen. Ze hebben geleid tot ontdekkingen van vele soorten cellen in een heterogene biologisch specimen door identificatie van hun unieke oppervlakte marker expressieprofielen. Verhoogde spectrum overlappingen die geassocieerd zijn met meer kanalen leidt tot hogere gegevens onnauwkeurigheid in fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen. Daarom worden ongewenste cellen routinematig verwijderd om de cel populaties van belang te verrijken voor fluorescentie-activated flow Cytometry analyse. Bijvoorbeeld, Ly6G (of GR-1) en CD11b worden beschouwd als volwassen myeloïde Cell markers en Ly6G+ (of GR-1+) en CD11b+ cellen worden routinematig verwijderd uit BM monsters met behulp van magnetische verrijking kits voorafgaand aan flow Cytometry analyse van hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) of door het combineren van deze markers in een dump cocktail kanaal1,2,3. Een ander voorbeeld is dat neutrofielen routinematig uit menselijk bloed specimen worden verwijderd om perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor immunologische studies te verrijken. Hele beenmerg geïsoleerd van de muis of de mens, echter, is zelden onderzocht intact voor Cytometry analyse.
Onlangs is CyTOF een revolutionair hulpmiddel geworden om het hematopoietische systeem4,5,6te onderzoeken. Met CyTOF, worden de fluorophore-geëtiketteerde antilichamen vervangen door zwaar element reporter-geëtiketteerde antilichamen. Deze methode maakt het mogelijk voor de meting van meer dan 40 markers gelijktijdig zonder de zorg van het spectrum overlap. Het heeft de analyse van intact biologisch specimen zonder pre-uitputtings stappen of een stortplaats kanaal toegelaten. Daarom kunnen we het hematopoietische systeem uitvoerig bekijken met een hoge-inhoud dimensionaliteit van conventionele 2-D flow Cytometry percelen. Cel populaties weggelaten in het verleden tijdens uitputting of gating proces kan nu worden gebracht in het licht met de High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF4,5. We hebben een antilichamen paneel ontworpen dat gelijktijdig 39 parameters in het hematopoietische systeem meet met een focus op de myeloïde linage7. Vergeleken met de conventionele flow Cytometry gegevens, de interpretatie en visualisatie van de ongekende single-cell High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF is een uitdaging. Computationele wetenschappers hebben ontwikkeld dimensionaliteit reductie technieken voor de visualisatie van High-dimensionale datasets. In dit artikel, gebruikten we het algoritme, viSNE, die t-Distributed stochastische buurman inbedding (t-GND) techniek gebruikt om de CyTOF gegevens te analyseren en om de High-dimensionale resultaat presenteren op een 2-dimensionale kaart, terwijl het behoud van de High-dimensionale structuur van de gegevens8,9,10. Op de tSNE plot worden soortgelijke cellen gegroepeerd in subsets en de kleur wordt gebruikt om de functie van de cellen te markeren. Bijvoorbeeld, op Figuur 1 worden de myeloïde cellen verdeeld in meerdere cel subsets gebaseerd op de gelijkenissen van hun expressie patronen van 33 oppervlakte markers vloeide voort uit CyTOF (Figuur 1)4. Hier hebben we onderzocht muis beenmerg met onze eerder gemelde 39-marker CyTOF panel door viSNE Analysis7. viSNE analyse van onze CyTOF gegevens bleek een niet-geïdentificeerde cel populatie die zowel HSPC (CD117+) en neutrofiele (Ly6G+) kenmerken (Figuur 2)7toonde.
Samenvattend, presenteren wij een protocol om vers geheel beenmerg voor CyTOF analyse te verwerken. In dit artikel, gebruikten we muis beenmerg als een voorbeeld, terwijl dit protocol kan ook worden gebruikt voor het verwerken van menselijk beenmerg monsters. De details die specifiek zijn voor het menselijk beenmerg monsters zijn ook vermeld in het protocol als goed. Het voordeel van dit protocol is dat het Details zoals incubatietijd en temperatuur bevat die werden geoptimaliseerd om neutrofiele-Lineage cellen in het gehele beenmerg te bewaren om onderzoek op het intacte gehele beenmerg toe te laten. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

In dit artikel presenteren we een protocol dat is geoptimaliseerd voor het behoud van neutrofiele-Lineage cellen in Fresh BM voor hele BM CyTOF analyse. We gebruikten een myeloïde-bevooroordeelde 39-antilichaam CyTOF panel om de hematopoietische systeem te evalueren met een focus op de neutrofiele-Lineage cellen met behulp van dit protocol. De CyTOF resultaat werd geanalyseerd met een open-resource dimensionale reductie algoritme, viSNE, en de gegevens werd gepresenteerd aan de uitkomst van dit protocol aan te tonen. We hebben ontdekt nieuwe neutrofiele-Lineage Cell populaties op basis van dit protocol. Dit Protocol van verse hele BM voorbereiding kan worden gebruikt voor 1), CyTOF analyse om niet-geïdentificeerde cel populaties te ontdekken van hele BM, 2), het onderzoeken van hele BM gebreken voor patiënten met bloedziekten zoals leukemie, 3), assisteren optimalisering van fluorescentie-activated flow Cytometry protocollen die gebruik maken van verse hele BM.

Figuur 1 wordt gepresenteerd als een voorbeeld resultaat van CyTOF experimenten. Op deze tSNE plot de cellen over meerdere muis weefsels werden geclusterd in deelverzamelingen op basis van de gelijkenis van hun oppervlakte marker expressieprofielen gemeten door een 33-parameter CyTOF paneel. Cellen met meer vergelijkbare eigenschappen werden automatisch gegroepeerd, zoals de neutrofielen, macrofagen, of de DCs gebaseerd op de expressie van de 33 markers op elke cel.
<p class="jove_conten...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Dit massacytometrieprotocol behoudt de integriteit van het hele beenmerg, waardoor de informatie die verloren ging tijdens de conventionele monstervoorbereiding voor analyse van onder bestudeerde cellen kan worden gered. Dit snelle en moeiteloze beenmergisolatieprotocol vergemakkelijkt de verwerving van levensvatbare myeloïde celpopulaties zoals zeldzame neutrofiele-lijnsubsets. Met behulp van massa cytometrie te identificeren eerder onder gewaardeerde immuuncellen zoals neutrofiele-lijncellen kan brede gevolgen hebben voor een breed scala van ziekten.Dit protocol behoudt de integriteit van de kortstondige myeloïde cellen die aanwezig zijn in het beenmerg en kan gemakkelijk worden toegepast op andere weefseltypes, zoals de vaste tumor. We hebben het protocol vereenvoudigd om het zo gebruiksvriendelijk mogelijk te maken, maar zoals in alle biologische studies kan het een paar praktijkruns nodig hebben om te beheren. Wanneer u dit de eerste keer doet, u al uw reagentia eerst klaar krijgen en dan strikt het protocol volgen.Als u problemen ondervindt, u verbinding maken met het CyTOForum en praten met andere CyTOF-gebruikers die kunnen helpen bij het oplossen van problemen. Voor biologische monsterbereiding kunnen eenvoudige trucs een enorm verschil maken met het eindresultaat. Een visuele demonstratie is veel gemakkelijker voor een nieuwe gebruiker om het protocol te begrijpen.Als u dit voor de eerste keer doet, u uw reagentia eerst klaar krijgen en vervolgens strikt het protocol volgen. Voor beenmergoogst, plaats een zes tot 10 weken oude C57 zwarte zes muis in de supine positie op een steriele chirurgische pad en gebruik 70% ethanol om de buik en achterste ledematen te steriliseren. Gebruik een paar ontleden chirurgische schaar om de buikholte te openen en verwijder de huid om de achterste ledematen bloot te stellen.Met behulp van een paar stompe getipte dressing tangen, houd de muis scheenbeen recht onder de enkel en gebruik een paar gebogen dressing tangen om het scheenbeen te stabiliseren onder de stompe getipt dressing tangen. Gebruik de stompe getipte dressing tangen om het scheenbeen te breken en verwijder de spier om het bot bloot te leggen. Voordat u het scheenbeen in koude PBS plaatst, verplaatst u de stabiliserende gebogen dressingkrachten naar het dijbeen en schuift u de stompe puntige dressing onder het kniegewricht om de knieschijf vast te houden.Trek voorzichtig omhoog om de knieschijf te ontwrichten en verwijder de spier uit de knieschijf om het dijbeen bloot te leggen. Houd het blootgestelde dijbeen vast door de gebogen dressingforceps en gebruik een chirurgische schaar om het dijbeen van de onderkant van het bot te snijden. Plaats het dijbeen dan in PBS.Gebruik vervolgens een 18-meter naald om een gat in een 0,5 milliliter microcentrifuge buis punch en plaats beide botten in de buis met de open uiteinden van de botten naar beneden gericht in het gat. Plaats de buis van 0,5 milliliter in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis en draai de dubbelgelaagde buizen in een microcentrifuge. Bevestig aan het einde van de centrifugatie dat het beenmerg naar de bodem van de buis is geëxtraheerd.Om de beenmergcellen te bevlekken voor massacytometrie, schorst u het beenmerg opnieuw in één milliliter rode bloedcelbuffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel aan het einde van de incubatie de cellen door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in één milliliter koude PBS. Filtreer de cellen door een zeef van 70 micrometer in een conische buis van 15 milliliter en was de cellen met negen milliliter verse, koude PBS.Stel de beenmergcelpellet opnieuw op in 10 milliliter verse, koude PBS voor het tellen en breng een vijf keer 10 naar de zesde cel aliquot in een nieuwe 15 milliliter buis. Verzamel de cellen door centrifugatie en opnieuw op te schorten de cellen in een milliliter van massa cytometrie kleuring buffer, aangevuld met 125 nanomolar cisplatine. Na vijf minuten bij kamertemperatuur, was de cellen in vier milliliter verse massa cytometrie buffer.Stel de pellet opnieuw op in 50 microliters van FC receptor blokkeren oplossing. Voeg na 10 minuten bij vier graden Celsius 50 microliters van de antilichaamcocktail van belang toe aan de cellen en laat u voorzichtig pipetten om te mengen. De temperatuur in verschillende incubatiestappen is erg belangrijk voor het behoud van de levensvatbaarheid van de beenmergcellen.Na 30 minuten bij vier graden Celsius, was de cellen twee keer in twee milliliter verse massa cytometrie buffer per wasbeurt voordat opnieuw opschorten van de cellen in een milliliter vers bereide 1,6%formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel aan het einde van de incubatie de cellen door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in één milliliter vaste permanent buffer aangevuld met 125 nanomolar intercalatieoplossing voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. Voor het analyseren van de cellen door massa cytometrie, voorzichtig vortex en centrifugeren de cel suspensie voor het wassen van de cellen in twee milliliter verse massa cytometrie kleuring buffer.Vervolgens was de cellen twee keer in een milliliter gedestilleerd water per wasbeurt, zorgvuldig aspirating de supernatant na de tweede wasbeurt alvorens opnieuw op te schorten de cellen op een keer 10 tot de zesde cellen per milliliter van massa cytometrie buffer concentratie voor massa cytometrie analyse. In deze T gedistribueerde stochastische buurman inbedding plot, de cellen over meerdere muisweefsels werden geclusterd in subsets op basis van de gelijkenis van hun oppervlak marker expressie profielen zoals gemeten door een 33 parameter massa cytometrie paneel. Cellen met meer vergelijkbare eigenschappen werden automatisch geclusterd op basis van de expressie van deze markeringen op elke cel.Met behulp van deze methode werd de integriteit van het hele beenmerg behouden, wat leidde tot de ontdekking van een voorheen onbekende celpopulatie die tegelijkertijd neutrofiele en hematopoietische stam- en voorlopercellen kenmerkende oppervlaktemarkers uitdrukt. Deze celpopulatie, die eerder werd weggelaten in myeloïde voorloperstudies, als gevolg van ly6G positieve celuitputting, vertoont een duidelijk patroon van oppervlaktemarkeringsexpressie. Wat nog belangrijker is, deze gegevens leidden tot de ontdekking van een kleine subset van de Ly6G positieve celcluster die Ly6G niet uitdrukt, maar dicht bij de positieve Ly6G positieve cellen CD117 werd geclusterd, wat de gelijkenis van deze cellen aan neutrofiele-lijn voorstelt die op de uitdrukking van de 33 oppervlaktemarkers wordt gebaseerd die in dit experiment van massacytrimetrie worden gebruikt.Een 13 kleur florescence geactiveerd cel sorteerpaneel kan dan worden gebouwd, waardoor de isolatie van de neutrophil voorlopers door flow cytometrie voor downstream functionele testen. Het is belangrijk om de beenmergisolatieprocedure zo snel mogelijk uit te voeren en de cellen op vier graden Celsius te houden tijdens de kleuringsprocedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...