Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Wir danken dem LJI Flow Cytometry Kern für die Unterstützung bei der Massenzytometrie. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R01HL134236, P01HL136275 und R01CA202987 (alle an C.C.H) und ADA7-12-MN-31 (04) (zu C.C.H. und Y.P.Z) unterstützt.

Alle Experimente folgten den anerkannten Richtlinien des La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, und die Zulassung für die Verwendung von Nagetieren wurde vom La Jolla Institute for Allergy and Immunology nach Kriterien gemäß den der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health.
1. Ernte Maus Knochenmark (BM)
<ol><li>Kaufen Sie C57BL/6J Mäuse von einem kommerziellen Anbieter. Füttern Sie die Standard-...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

In den vergangenen Jahrzehnten wurde die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie als Hauptmethode zur Untersuchung zellulärer Abstammungundlzeichen und Heterogenität1,2,3verwendet. Obwohl die Durchflusszytometrie mehrdimensionale Daten lieferte, ist diese Methode durch die Auswahl von Parametern und spektralen Überlappungen eingeschränkt. Um die Schwäche der Durchflusszytometrie zu überwinden, nutzten wir CyTOF, das schwe...

In den letzten Jahrzehnten waren Zytometrie-Methoden ein leistungsfähiges Werkzeug, um das hämatopoetische System im BM zu untersuchen. Zu diesen Methoden gehören fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie und die neue Methode der CyTOF mit schwermetallbeschriftten Antikörpern. Sie haben durch die Identifizierung ihrer einzigartigen Oberflächenmarker-Expressionsprofile zu Entdeckungen vieler Zelltypen in einer heterogenen biologischen Probe geführt. Erhöhte Spektrumüberlappungen, die mit mehr Kanälen verbunden sind, führen zu einer höheren Datenungenauigkeit in fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrieanwendungen. Daher werden unerwünschte Zellen routinemäßig entfernt, um Zellpopulationen von Interesse für die Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanalyse zu bereichern. Beispielsweise gelten Ly6G (oder Gr-1) und CD11b als reife myeloische Zellmarker und Ly6G+ (oder Gr-1+) und CD11b+ Zellen werden routinemäßig aus BM-Proben entfernt, indem magnetische Anreicherungskits verwendet werden, bevor die Durchflusszytometrieanalyse hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) oder durch Kombination dieser Marker in einem Dump-Cocktail-Kanal1,2,3. Ein weiteres Beispiel ist, dass Neutrophile routinemäßig aus menschlichen Blutproben entfernt werden, um periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) für immunologische Studien anzureichern. Ganzes Knochenmark, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, wird jedoch selten intakt für die Zytometrieanalyse untersucht.
In letzter Zeit ist CyTOF zu einem revolutionären Werkzeug geworden, um das hämatopoetische System4,5,6zuuntersuchen. Mit CyTOF werden die fluorophor-markierten Antikörper durch schwere, von Reportern gekennzeichnete Antikörper ersetzt. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von über 40 Markern ohne die Sorge um die Überlappung des Spektrums. Es hat die Analyse intakter biologischer Proben ohne Vorabbauschritte oder einen Deponiekanal ermöglicht. Daher können wir das hämatopoetische System umfassend mit hoher Content-Dimensionalität aus herkömmlichen 2D-Flow-Zytometrie-Plots betrachten. Zellpopulationen, die in der Vergangenheit während des Erschöpfungs- oder Gatingprozesses weggelassen wurden, können nun mit den von CyTOF4,5erzeugten hochdimensionalen Daten ans Licht gebracht werden. Wir haben ein Antikörper-Panel entwickelt, das gleichzeitig 39 Parameter im hämatopoetischen System misst, mit einem Fokus auf die myeloische Linage7. Im Vergleich zu den herkömmlichen Flow-Zytometrie-Daten ist die Interpretation und Visualisierung der beispiellosen einzelzelligen hochdimensionalen Daten, die von CyTOF generiert werden, eine Herausforderung. Computerwissenschaftler haben Maßalitätsreduktionstechniken zur Visualisierung hochdimensionaler Datensätze entwickelt. In diesem Artikel verwendeten wir den Algorithmus viSNE, der t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) Technik verwendet, um die CyTOF-Daten zu analysieren und das hochdimensionale Ergebnis auf einer 2-dimensionalen Karte zu präsentieren, während die hochdimensionale Struktur konserviert wird. der Daten8,9,10. Im tSNE-Diagramm werden ähnliche Zellen in Teilmengen gruppiert, und die Farbe wird verwendet, um das Feature der Zellen hervorzuheben. In Abbildung 1 werden die myeloischen Zellen z. B. in mehrere Zellteilmengen verteilt, basierend auf den Ähnlichkeiten ihrer Expressionsmuster von 33 Oberflächenmarkern, die aus CyTOF resultieren (Abbildung 1)4. Hier untersuchten wir Mausknochenmark mit unserem zuvor berichteten 39-Marker CyTOF Panel durch viSNE-Analyse7. viSNE-Analyse unserer CyTOF-Daten ergab eine nicht identifizierte Zellpopulation, die sowohl HSPC -(CD117+) als auch Neutrophilen (Ly6G+) Merkmale zeigte (Abbildung 2)7.
Abschließend stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung eines frischen ganzen Knochenmarks für die CyTOF-Analyse vor. In diesem Artikel haben wir als Beispiel Mausknochenmark verwendet, während dieses Protokoll auch zur Verarbeitung menschlicher Knochenmarkproben verwendet werden kann. Die spezifischen Details für menschliche Knochenmarkproben sind auch im Protokoll vermerkt. Der Vorteil dieses Protokolls ist, dass es Details wie Inkubationszeit und Temperatur enthält, die optimiert wurden, um Neutrophilen-Linienzellen im gesamten Knochenmark zu erhalten, um eine Untersuchung des intakten gesamten Knochenmarks zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann auch leicht für Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanwendungen geändert werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll vor, das optimiert ist, um Neutrophilen-Linienzellen in frischem BM für die gesamte BM CyTOF-Analyse zu erhalten. Wir nutzten ein myeloisch-voreingenommenes 39-Antikörper-CyTOF-Panel, um das hämatopoetische System mit einem Fokus auf die Neutrophilen-Linienzellen mit diesem Protokoll zu bewerten. Das CyTOF-Ergebnis wurde mit einem Open-Resource-Dimensionsreduktionsalgorithmus viSNE analysiert, und die Daten wurden vorgestellt, um das Ergebnis dieses Protokolls zu demonstrieren. Wir haben neue neutrophil-lineage Zellpopulationen auf der Grundlage dieses Protokolls entdeckt. Dieses Protokoll der frischen gesamten BM-Präparation kann für 1), CyTOF-Analyse verwendet werden, um nicht identifizierte Zellpopulationen aus ganz BM zu entdecken, 2), die Untersuchung ganzer BM-Defekte bei Patienten mit Bluterkrankungen wie Leukämie, 3), fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrieprotokolle, die frische sermierte bm verwenden.

Abbildung 1 wird als Beispiel aus CyTOF-Experimenten dargestellt. Auf diesem tSNE-Diagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, die von einem CyTOF-Panel mit 33 Parametern gemessen wurden, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlichen Eigenschaften wurden automatisch gruppiert, z. B. Die Neutrophile, Makrophagen oder die DCs basierend auf der Expression der 33 Marker auf jeder Zelle.
<p class="jove_content...

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Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Dieses Massenzytometrie-Protokoll bewahrt die Integrität des gesamten Knochenmarks und ermöglicht die Rettung der Informationen, die während der konventionellen Probenvorbereitung für die Analyse unter untersuchter Zellen verloren gegangen sind. Dieses schnelle und mühelose Knochenmark-Isolationsprotokoll erleichtert den Erwerb lebensfähiger kurzlebiger myeloischer Zellpopulationen wie seltener Neutrophilen-Lineage-Subsets. Die Verwendung von Massenzytometrie zur Identifizierung zuvor unterschätzter Immunzellen wie Neutrophilen-Linienzellen kann weitreichende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Krankheiten haben.Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der kurzlebigen myeloischen Zellen, die im Knochenmark vorhanden sind und leicht auf andere Gewebetypen wie den soliden Tumor angewendet werden können. Wir haben das Protokoll vereinfacht, um es so benutzerfreundlich wie möglich zu gestalten, aber wie in allen biologischen Studien kann es einige Übungsläufe benötigen, um es zu verwalten. Wenn Sie dies zum ersten Mal tun, können Sie zuerst alle Ihre Reagenzien fertig stellen und dann das Protokoll strikt befolgen.Wenn Probleme auftreten, können Sie eine Verbindung zum CyTOForum herstellen und mit anderen CyTOF-Benutzern sprechen, die Ihnen bei der Fehlerbehebung helfen können. Bei der biologischen Probenvorbereitung können einfache Tricks mit dem Endergebnis einen großen Unterschied machen. Eine visuelle Demonstration ist für einen neuen Benutzer viel einfacher, das Protokoll zu erfassen.Wenn Sie dies zum ersten Mal tun, können Sie Ihre Reagenzien zuerst fertig stellen und dann strikt dem Protokoll folgen. Für die Knochenmarkernte eine sechs bis zehn Wochen alte C57 schwarze Sechsmaus in die Supine-Position auf einem sterilen chirurgischen Pad legen und 70% Ethanol verwenden, um den Bauch und die Hinterbeine zu sterilisieren. Verwenden Sie eine sezierende chirurgische Schere, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Haut zu entfernen, um die Hinterbeine freizulegen.Halten Sie die Maustibia mit einem Paar stumpf gekippten Anreifungszangen direkt unter dem Knöchel und verwenden Sie ein Paar gekrümmte Verbandszangen, um die Tibia unter den stumpf gekippten Anreifungszangen zu stabilisieren. Verwenden Sie die stumpf gekippten Anziehzange, um die Tibia zu brechen und den Muskel zu entfernen, um den Knochen freizulegen. Bevor Sie die Tibia in kalteS PBS legen, bewegen Sie die stabilisierenden gekrümmten Verbandszangen zum Oberschenkelknochen und schieben Sie die stumpf gekippten Verbandszangen unter das Kniegelenk, um die Kniescheibe zu halten.Ziehen Sie vorsichtig nach oben, um die Kniescheibe zu verrenken und entfernen Sie den Muskel von der Kniescheibe, um den Oberschenkelknochen freizulegen. Halten Sie den freiliegenden Oberschenkelknochen durch die gekrümmten Verbandszangen und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Oberschenkelknochen von der Unterseite des Knochens zu schneiden. Legen Sie dann den Oberschenkelknochen in PBS.Als nächstes verwenden Sie eine 18-Spur-Nadel, um ein Loch in ein 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu schlagen und legen Sie beide Knochen in das Rohr mit den offenen Enden der Knochen nach unten in das Loch. Legen Sie das 0,5-Milliliter-Rohr in ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und drehen Sie die doppelschichtigen Rohre in einer Mikrozentrifuge. Bestätigen Sie am Ende der Zentrifugation, dass das Knochenmark an den Boden des Rohres extrahiert wurde.Um die Knochenmarkzellen für die Massenzytometrie zu färben, setzen Sie das Knochenmark in einem Milliliter roter BlutkörperchenLysepuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur wieder auf. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in einem Milliliter kalten PBS wieder aufhängen. Filtern Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein 15 Milliliter konisches Rohr und waschen Sie die Zellen mit neun Millilitern frischer, kalter PBS.Setzen Sie das Knochenmarkzellpellet in 10 Milliliter frischer, kalter PBS zum Zählen wieder auf und übertragen Sie fünfmal 10 in die sechste Zelle aliquot in eine neue 15 Milliliter-Röhre. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Massenzytometrie-Färbungspuffer, ergänzt durch 125 Nanomolar Cisplatin. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Zellen in vier Milliliter frischer Massezytometriepuffer waschen.Das Pellet in 50 Mikroliter FC-Rezeptor-Blockierlösung wieder aussetzen. Nach 10 Minuten bei vier Grad Celsius 50 Mikroliter des von Interesse sindden Antikörpercocktails in die Zellen geben und sanft pfeifen, um sie zu mischen. Die Temperatur in verschiedenen Inkubationsschritten ist sehr wichtig, um die Lebensfähigkeit der Knochenmarkzellen zu erhalten.Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen zweimal in zwei Millilitern frischer Massezytometriepuffer pro Wäsche waschen, bevor die Zellen in einem Milliliter frisch zubereitetem 1,6%Formaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur wieder aufgesetzt werden. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in einem Milliliter festen Permpuffer sanieren, ergänzt mit 125 nanomolaren Interkalationslösung für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius. Vor der Analyse der Zellen durch Massenzytometrie, sanft Wirbel und Zentrifugieren der Zellsuspension vor dem Waschen der Zellen in zwei Milliliter frische Masse Zytometrie Färbung Puffer.Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal in einem Milliliter destilliertem Wasser pro Wäsche, sorgfältig aspirating der Überstand nach der zweiten Wäsche, bevor sie die Zellen wieder auf einmal 10 bis sechs Liter Pro Milliliter Masse Zytometrie Pufferkonzentration für Masse Zytometrie-Analyse. In diesem T verteilten stochastischen Einbettungsdiagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, gemessen durch ein 33-Parameter-Massenzytometrie-Panel, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlicheren Eigenschaften wurden automatisch basierend auf der Ausprägung dieser Marker auf jeder Zelle gruppiert.Mit dieser Methode wurde die Integrität des gesamten Knochenmarks erhalten, was zur Entdeckung einer bisher unbekannten Zellpopulation führte, die gleichzeitig neutrophilund hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen mitdrückt. Diese Zellpopulation, die zuvor in myeloischen Vorläuferstudien aufgrund der ly6G-positiven Zellerschöpfung weggelassen wurde, weist ein deutliches Muster der Oberflächenmarkerexpression auf. Noch wichtiger ist, dass diese Daten zur Entdeckung einer kleinen Teilmenge des Ly6G-positiven Zellclusters führten, die Ly6G nicht ausdrückt, aber eng an die CD117-positiven Ly6G-positiven Zellen gruppiert wurde, was auf die Ähnlichkeit dieser Zellen mit der Neutrophilen-Linie auf der Grundlage der Expression der 33 Oberflächenmarker hindeutet, die in diesem Massenzytometrie-Experiment verwendet werden.Eine 13 Farbfloreszenz aktivierte Zellsortierung Panel könnte dann gebaut werden, so dass die Isolierung der neutrophilen Vorläufer durch Durchflusszytometrie für nachgeschaltete funktionelle Assays. Es ist wichtig, den Knochenmark-Isolationsverfahren so schnell wie möglich durchzuführen und die Zellen während des Färbevorgangs bei vier Grad Celsius zu halten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...