Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

היינו רוצים להודות לזרימת LJI הליבה Cy, לקבלת סיוע עם הליך המוני cy, try. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01HL134236, P01HL136275, ו R01CA202987 (כולם C. C. H) ו ADA7-12-MN-31 (04) (כדי C.C.H. ו-Y. P. Z).

כל הניסויים עקבו אחר ההנחיות המאושרות של מכון לה הויה לטיפול בבעלי חיים ולבריאות ולשימוש בחיות מכרסמים, ואישור לשימוש במכרסמים התקבל ממכון לה הויה לאלרגיה ואימונולוגיה לפי קריטריונים המתוארים ב המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ממוסדות הבריאות הלאומיים.
1. בציר עצם העכבר מח...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

בעשורים האחרונים, זרימה המבוססת על קרינה פלואורסצנטנסה שימש כשיטה העיקרית ללמוד ליננים הסלולר ו טרוגניות1,2,3. למרות הזרימה cy, try סיפק נתונים רב מימדי, שיטה זו מוגבלת על ידי בחירות של פרמטרים חפיפה ספקטרלית. כדי להתגבר על החולשות של הזרימה cy...

בעשורים האחרונים, שיטות cy, לנסות כבר כלי רב עוצמה כדי לחקור את המערכת המטטית ב BM. שיטות אלו כוללות שימוש בזרימה פלואורסצנטית המופעל באמצעות נוגדנים והשיטה החדשה של Cyתוף באמצעות מתכת כבדה בעלת תוויות. הם הובילו לתגליות של סוגי תאים רבים בדגימה ביולוגית הטרוגנית על-ידי זיהוי פרופילי הביטוי הייחודי שלהם משטח הסמן. הגבירו את הספקטרום חופפים זה משויך עם ערוצים יותר מוביל הנתונים הגבוהים יותר חוסר דיוק בזרם המופעל על ידי הקרינה ביישומים cy, לנסות. לכן, תאים לא רצויים מוסרים באופן שגרתי כדי להעשיר אוכלוסיות תאים של עניין של זרימה המופעל על ידי הזרם הפלואורסצנטית הפעלה cy, לנסות. לדוגמה, Ly6G (או Gr-1) ו-CD11b נחשבים לסמנים בוגרים של תאים מיאלואידים ו-Ly6G+ (או gr-1+) ו-CD11b+ תאים מוסרים באופן שגרתי מדגימות BM באמצעות ערכות העשרה מגנטיות לפני שהוא מנתח את הניתוח cytometry של גזע המטפאות ותאים מחולל שדות (hspcs) או על-ידי שילוב סמנים אלה בערוץ הקוקטייל אחד מזבלה1,2,3. דוגמה נוספת היא כי נויטרופילים הם הוסר באופן שגרתי מן הדגימה דם אנושי כדי להעשיר את הדם ההיקפית תאים מונפנקות (PBMC) למחקרים אימונולוגיים. מח עצם שלם מבודד מעכבר או בן אדם, עם זאת, הוא נחקר לעתים נדירות ללא פגע לניתוח cy, try.
לאחרונה, cytof הפך לכלי מהפכני לחקור את מערכת המטפאות4,5,6. עם CyTOF, הנוגדנים המתויגים בתווית מוחלפים בנוגדנים כבדים המסומנים בכתב. שיטה זו מאפשרת את המדידה של מעל 40 סמנים בו ללא החשש של חפיפת ספקטרום. הוא איפשר ניתוח של דגימה ביולוגית שלמה ללא שלבי המחסור מחסור או ערוץ dump. לכן, אנו יכולים להציג את המערכת המטטית באופן מקיף עם מימדי התוכן הגבוה מתוך מגרשים קונבנציונליים דו-מימדית של הזרימה. אוכלוסיות תאים שהושמטו בעבר במהלך תהליך של דלדול או מחסור יכול כעת להיות מובא לאור עם נתונים מימדים גבוהים שנוצרו על ידי cytof4,5. עיצבנו פאנל נוגדן המודד בו 39 פרמטרים במערכת המטפאות עם דגש על מיניאיד מיאלואידית7. לעומת הזרימה המקובלת cy, לנסות נתונים, פרשנות והדמיה של הנתונים חסר תקדים של תא יחיד מימדי שנוצר על ידי Cyתוף הוא מאתגר. מדענים חישוביים פיתחו טכניקות הפחתה ממדיות להדמיה של ערכות נתונים ממדיות גבוהות. במאמר זה, השתמשנו באלגוריתם, ויסבנה, שעושה שימוש בטכניקת הטבעה מבוזרת של סטוכסטי שכנים (t-SNE) כדי לנתח את הנתונים של CyTOF ולהציג את התוצאה הגבוהה ביותר במפה דו-ממדית תוך שימור המבנה הגבוה . הנתונים8,9,10 בחלקה tSNE, תאים דומים מקובצים לקבוצות ממשנה והצבע משמש להדגשת התכונה של התאים. לדוגמה, באיור 1 התאים המייאלואידים מופצים לקבוצות משנה של תאים בהתבסס על קווי הדמיון של דפוסי הביטוי שלהם של 33 פני השטח הנובעות מציתוף (איור 1)4. כאן חקרנו מח עצם העכבר עם שלנו דיווחו בעבר 39-סמן CyTOF הפאנל על ידי ניתוח ויסבנה7. בדיקת ובדיקה של הנתונים שלנו CyTOF חשף אוכלוסיית תאים בלתי מזוהה שהראה הן HSPC (CD117+) ו נויטרופילים (Ly6G+) מאפיינים (איור 2)7.
לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול לעיבוד מח עצם טרי שלם עבור ניתוח CyTOF. במאמר זה, השתמשנו מח עצם העכבר כדוגמה, בעוד פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לעבד את דגימות מח העצם האנושית. הפרטים הספציפיים לדגימות מח העצם האנושי גם כן מפורטים בפרוטוקול. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא מכיל פרטים כגון זמן דגירה הטמפרטורה שהיו ממוטבת לשמר את התאים נויטרופילים השושלת במוח העצם כדי לאפשר חקירה על מח עצם שלם שלם. פרוטוקול זה עשוי להיות גם שונה בקלות עבור הפעלת קרינה פלואורסצנטית יישומים המופעל.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול כי הוא ממוטב כדי לשמר את התאים נויטרופילים השושלת בתוך מוניטור טרי עבור ניתוח של BM CyTOF שלם. אנו מנוצל מיאלואידית משוחדת 39-נוגדן הפאנל CyTOF להעריך את המערכת המטתית עם דגש על התאים נויטרופילים-השושלת באמצעות פרוטוקול זה. תוצאת הארגון נותחה באמצעות אלגוריתם להפחתת מימדים פתוח, והנתונים הוצגו כדי להדגים את התוצאה של פרוטוקול זה. גילינו אוכלוסיות חדשות של ניופיל-יוחסין. המבוססות על הפרוטוקול הזה פרוטוקול זה של הכנה מסוג חדש של מוניטור מלאה עשוי לשמש 1), ניתוח CyTOF לגלות אוכלוסיות תאים בלתי מזוהה מ-BM שלם, 2), חקירת פגמים מסוג BM עבור חולים עם הפרעות דם כגון לוקמיה, 3), סיוע אופטימיזציה של מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית זרימה cy, לנסות לנצל את מוניטור שלם טרי.

איור 1 מוצג כתוצאה דוגמה מניסויי cytof. בהתוויה זו מתווה את התאים באמצעות מספר ממחטות עכבר שעברו באשכולות לקבוצות ממשנה, בהתבסס על הדמיון של פרופילי הביטוי שלהם מסמן פני השטח, הנמדד על-ידי החלונית ה33 של CyTOF. תאים עם מאפיינים דומים יותר היו מקובצים באופן אוטומטי יחד כגון נויטרו?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לעבד מח עצם טרי (BM) מבודד מעכבר או בן אדם עבור cy, מימדי המונית ההמוני (Cy, Try על ידי זמן הטיסה, Cy,) ניתוח של תאי השושלת של נויטרופילים.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

פרוטוקול ציטומטריה המונית זה משמר את שלמות מח העצם כולו, ומאפשר להציל את המידע שאבד במהלך הכנת מדגם קונבנציונלי לניתוח של תאים שנחקרו. פרוטוקול בידוד מח עצם מהיר ובלתי מאמץ זה מאפשר רכישה של אוכלוסיות תאי מיאלואידים קצרי מועד, כגון תת-קבוצות נדירות של שושלת נויטרופילים. שימוש בציטומטריה המונית כדי לזהות בעבר תחת תאים חיסוניים מוערכים כגון תאים נויטרופילים-שושלת עשוי להיות השלכות רחבות על מגוון רחב של מחלות.פרוטוקול זה משמר את שלמות התאים המיאלואידיים קצרי החיים הקיימים במח העצם ונוזלים להיות מיושמים בקלות על סוגי רקמות אחרים כגון הגידול המוצק. פישטנו את הפרוטוקול כדי להפוך אותו ידידותי למשתמש ככל האפשר, אבל כמו בכל המחקרים הביולוגיים זה עשוי להזדקק לכמה ריצות תרגול כדי לנהל. כאשר אתה עושה את זה בפעם הראשונה, אתה יכול לקבל את כל reagents שלך מוכן הראשון ולאחר מכן בקפדנות בצע את הפרוטוקול.אם אתה נתקל בבעיות כלשהן, באפשרותך להתחבר ל- CyTOForum ולדבר עם משתמשי CyTOF אחרים שיכולים לסייע בפתרון בעיות. להכנת מדגם ביולוגי, טריקים פשוטים יכולים לעשות הבדל עצום עם התוצאה הסופית. הדגמה חזותית היא הרבה יותר קלה עבור משתמש חדש לתפוס את הפרוטוקול.אם אתה עושה את זה בפעם הראשונה, אתה יכול לקבל את reagents שלך מוכן הראשון ולאחר מכן בקפדנות בצע את הפרוטוקול. לקציר מח עצם, מניחים עכבר C57 שחור בן שישה עד עשרה שבועות בתמונת השופע על כרית כירורגית סטרילית ולהשתמש 70% אתנול כדי לעקר את הבטן ואת הגפיים האחוריות. השתמש בזוג מספריים כירורגיים לנתח כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את העור כדי לחשוף את הגפיים האחוריות.באמצעות זוג מעצורי ההלבשה קהה הטה, להחזיק את השוקה העכבר ממש מתחת לקרסול ולהשתמש זוג מעצורי ההלבשה מעוקל לייצב את השוקה מתחת מעצורי ההלבשה קהה הטה. השתמש מאלץ ההלבשה קהה הטה לשבור את השוקה ולהסיר את השריר כדי לחשוף את העצם. לפני הנחת השוקה ב- PBS קר, להזיז את מטלפסי ההלבשה המעוקלים המייצבים אל עצם הירך ולהחליק את מעצורי ההלבשה קהה קצה מתחת למפרק הברך להחזיק את פיקת הברך.בעדינות למשוך את כדי לסלק את פיקת הברך ולהסיר את השריר מן פיקת הברך כדי לחשוף את עצם הירך. החזק את עצם הירך החשופה על ידי מעצורי ההלבשה המעוקלים ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את עצם הירך מתחתית העצם. ואז למקם את עצם הירך ב- PBS.לאחר מכן, השתמש במחט 18 מד כדי לנקר חור בצינור מיקרו צנטריפוגה 0.5 מיליליטר ולמקום את שתי העצמות בצינור עם הקצוות הפתוחים של העצמות פונה כלפי מטה לתוך החור. מניחים את הצינור 0.5 מיליליטר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.7 מיליליטר ולסובב את הצינורות שכבתי כפול בצנטריפוגה מיקרו. בסוף הצנטריפוגה, לאשר כי מח העצם כבר מופק לתחתית הצינור.כדי להכתים את תאי מח העצם עבור ציטומטריה המונית, להשעות מחדש את מח העצם במיליליטר אחד של חיץ תריס תא דם אדום במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה במיליליטר אחד של PBS קר. לסנן את התאים דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ולשטוף את התאים עם תשעה מיליליטר של PBS טרי, קר.להשעות מחדש את גלולת תא מח העצם ב 10 מיליליטר של PBS טרי, קר לספירה ולהעביר חמש פעמים 10 כדי aliquot התא השישי לתוך צינור חדש 15 מיליליטר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את התאים במיליליטר אחד של חיץ הכתמת ציטומטריה המונית, בתוספת 125 ציספלטין ננומולרי. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים בארבעה מיליליטר של חיץ ציטומטריה מסה טרי.להשעות מחדש את גלולה ב 50 microliters של פתרון חסימת קולטן FC. לאחר 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים המעניין את התאים ומערבבים בעדינות. הטמפרטורה בשלבי דגירה שונים חשובה מאוד בשימור הכדאיות של תאי מח העצם.לאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים פעמיים בשני מיליליטר של חיץ ציטומטריה מסה טרי לכל לשטוף לפני השעיית התאים במיליליטר אחד של פורמלדהיד מוכן טרי 1.6% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה במיליליטר אחד של חיץ סלם קבוע בתוספת 125 פתרון אינטרקלציה ננומולרי עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. לפני ניתוח התאים על ידי ציטומטריה המונית, בעדינות מערבולת צנטריפוגה ההשעיה התא לפני שטיפת התאים בשני מיליליטר של חיץ כתמים ציטומטריה מסה טרי.לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים במיליליטר אחד של מים מזוקקים לכל לשטוף, בזהירות שאף את supernatant לאחר לשטוף השני לפני השעיית התאים באחת פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר של ריכוז חיץ ציטומטריה המונית לניתוח ציטומטריה המונית. בעלילה זו של הטבעה של שכן סטוכסטי מבוזר T, התאים על פני רקמות עכבר מרובות היו מקובצים בתת-קבוצות בהתבסס על הדמיון של פרופילי ביטוי סמן פני השטח שלהם כפי שנמדדו על-ידי לוח ציטומטריה של מסה של 33 פרמטרים. תאים בעלי מאפיינים דומים יותר קובצו יחד באופן אוטומטי בהתבסס על הביטוי של סמנים אלה בכל תא.בשיטה זו, שלמות מח העצם כולו נשמרה, מה שהוביל לגילוי אוכלוסיית תאים שלא הייתה ידועה קודם לכן, המבטאת בו זמנית נויטרופילים ותאי ההמוטופיטיים וסמני משטח חתימה של תאי ההמה. אוכלוסיית תאים זו, שהושמטה בעבר במחקרי אבי מיאלואידים, עקב דלדול תאים חיובי Ly6G, מציגה תבנית ברורה של ביטוי סמן פני השטח. חשוב מכך, נתונים אלה הובילו לגילוי תת-קבוצה קטנה של אשכול התאים החיובי Ly6G שאינו מבטא Ly6G, אך היה מקובץ בשיתוף פעולה הדוק לתאים החיוביים של CD117 Ly6G, מה שמרמז על הדמיון בין תאים אלה לשושלת הנויטרופילים בהתבסס על הביטוי של 33 סמני פני השטח המשמשים בניסוי ציטומיה המוני זה.לאחר מכן ניתן היה לבנות לוח מיון תאים המופעל על ידי 13 צבעים, המאפשר בידוד של הצייטומיטורים הנויטרופילים על ידי ציטומטריית זרימה לצורך בדיקות תפקודיות במורד הזרם. חשוב לבצע את הליך בידוד מח העצם מהר ככל האפשר ולשמור על התאים בארבע מעלות צלזיוס במהלך הליך הכתם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...