Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
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हम बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री प्रक्रिया के साथ सहायता के लिए LJI प्रवाह साइटोमेट्री कोर धन्यवाद देना चाहते हैं. यह काम NIH अनुदान R01HL134236, P01HL136275, और R01CA202987 (सभी C.C.H) और ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. और Y.P.$) द्वारा समर्थित किया गया था.

सभी प्रयोगों एलर्जी और इम्यूनोलॉजी पशु देखभाल और उपयोग समिति के लिए ला Jolla संस्थान के अनुमोदित दिशा निर्देशों के बाद, और कृन्तकों के उपयोग के लिए अनुमोदन में उल्लिखित मानदंडों के अनुसार एलर्जी और इम्य?...

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	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

पिछले दशकों में, फ्लोरोसेंट आधारित प्रवाह साइटोमेट्री कोशिकीय वंशों और विषमता1,2,3का अध्ययन करने के लिए मुख्य विधि के रूप में प्रयोग किया गया था। हालांकि प्रवाह साइट?...

पिछले कुछ दशकों में, साइटोमेट्री तरीकों बीएम में hematopoietic प्रणाली की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है। इन विधियों में फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री और भारी धातु लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके CyTOF की नई विधि शामिल है। वे अपने अद्वितीय सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल की पहचान द्वारा एक विषम जैविक नमूना में कई सेल प्रकार की खोजों के लिए नेतृत्व किया है. अधिक चैनलों के साथ जुड़े स्पेक्ट्रम ओवरलैप फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री अनुप्रयोगों में उच्च डेटा अशुद्धि की ओर जाता है। इसलिए, अवांछित कोशिकाओं को नियमित रूप से फ्लोरोसेंट-सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए ब्याज की सेल आबादी को समृद्ध करने के लिए हटा दिया जाता है। उदाहरण के लिए, Ly6G (या Gr-1) और CD11b परिपक्व माइलॉयड सेल मार्कर और Ly6G+ (या Gr-1+) और CD11b+ कोशिकाओं को नियमित रूप से चुंबकीय संवर्धन किट का उपयोग करके बी एम नमूनों से हटा रहे हैं माना जाता है के प्रवाह से पहले साइटोमेट्री विश्लेषण हेमाटोपोएटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) या एक डंप कॉकटेल चैनल1,2,3में इन मार्करों के संयोजन के द्वारा . एक अन्य उदाहरण यह है कि न्यूट्रोफिल को नियमित रूप से मानव रक्त नमूने से हटा दिया जाता है ताकि प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को समृद्ध किया जा सके। माउस या मानव से अलग पूरे अस्थि मज्जा, तथापि, शायद ही कभी साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए बरकरार जांच की है.
हाल ही में, CyTOF hematopoietic प्रणाली4,5,6की जांच करने के लिए एक क्रांतिकारी उपकरण बन गया है. CyTOF के साथ, फ्लोरोफोर-लेबल एंटीबॉडी को भारी तत्व रिपोर्टर-लेबल एंटीबॉडी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। इस विधि स्पेक्ट्रम ओवरलैप की चिंता के बिना एक साथ 40 से अधिक मार्करों की माप के लिए अनुमति देता है. यह पूर्व कमी कदम या एक डंप चैनल के बिना बरकरार जैविक नमूना के विश्लेषण में सक्षम है. इसलिए, हम पारंपरिक 2-डी प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों से उच्च-सामग्री आयामीता के साथ हेमेटोपोएटिक प्रणाली को व्यापक रूप से देख सकते हैं। कमी या गेटिंग प्रक्रिया के दौरान अतीत में छोड़ी गई कोशिका आबादी को अब CyTOF4,5 द्वारा उत्पन्न उच्च आयामी डेटा के साथ प्रकाश में लाया जा सकताहै। हमने एक एंटीबॉडी पैनल तैयार किया है जो एक साथ माइलॉयड लिनेज7पर ध्यान देने के साथ ही हेमाटोपोइटिक प्रणाली में 39 पैरामीटरों को मापता है . पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री डेटा की तुलना में, CyTOF द्वारा उत्पन्न अभूतपूर्व एकल सेल उच्च आयामी डेटा की व्याख्या और दृश्यावलोकन चुनौतीपूर्ण है। अभिकलनीय वैज्ञानिकों ने उच्च आयामी डेटासेट के दृश्य के लिए विमीयता न्यूनीकरण तकनीक विकसित की है। इस आलेख में, हमने एल्गोरिथ्म, viSNE का उपयोग किया है, जो t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) तकनीक का उपयोग CyTOF डेटा का विश्लेषण करने के लिए और उच्च-आयामी संरचना को संरक्षित करते समय 2-आयामी मानचित्र पर उच्च-आयामी परिणाम प्रस्तुत करने के लिए करता है के डेटा8,9,10. TSNE प्लॉट पर, समान कक्ष सबसेट में संकुल होते हैं और कक्षों की सुविधा को हाइलाइट करने के लिए रंग का उपयोग किया जाता है. उदाहरण के लिए, चित्र 1 पर माइलॉयड कोशिकाओं को CyTOF (चित्र 1)4से प्राप्त 33 सतह मार्करों के उनके अभिव्यक्ति पैटर्न की समानता के आधार पर कई सेल सबसेट में वितरित किए जाते हैं। यहाँ हम हमारे पहले की सूचना के साथ माउस अस्थि मज्जा की जांच की 39-मार्कर CyTOF पैनल viSNE विश्लेषणद्वारा 7. हमारे CyTOF डेटा के viSNE विश्लेषण एक अज्ञात सेल आबादी है कि दोनों HSPC ( CD117+ )और न्यूट्रोफिल (Ly6G+ )विशेषताओं से पता चला पता चला (चित्र 2)7.
अंत में, हम CyTOF विश्लेषण के लिए ताजा पूरे अस्थि मज्जा प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस लेख में, हम एक उदाहरण के रूप में माउस अस्थि मज्जा का इस्तेमाल किया, जबकि इस प्रोटोकॉल भी मानव अस्थि मज्जा के नमूने की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मानव अस्थि मज्जा के नमूने के लिए विशिष्ट विवरण भी प्रोटोकॉल में नोट कर रहे हैं के रूप में अच्छी तरह से. इस प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि इसमें ऊष्मायन समय और तापमान जैसे विवरण शामिल हैं जिन्हें पूरे अस्थि मज्जा में न्यूट्रोफिल-लाइनेज कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया गया था ताकि बरकरार पूरे अस्थि मज्जा पर जांच को सक्षम किया जा सके। इस प्रोटोकॉल भी आसानी से फ्लोरोसेंट सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

इस आलेख में, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो पूरे बीएम CyTOF विश्लेषण के लिए ताजा बीएम में न्यूट्रोफिल-लाइनेज कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है। हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके न्यूट्रोफिल वंश कोशिकाओं पर ध्यान देने के साथ hematopoietic प्रणाली का मूल्यांकन करने के लिए एक माइलॉयड पूर्वाग्रह 39-एंटीबॉडी CyTOF पैनल का उपयोग किया। CyTOF परिणाम एक खुला संसाधन आयामी कमी एल्गोरिथ्म, viSNE के साथ विश्लेषण किया गया था, और डेटा इस प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत किया गया था. हमने इस प्रोटोकॉल के आधार पर नए न्यूट्रोफिल-लाइनेज सेल की आबादी की खोज की है। ताजा पूरे बीएम तैयारी के इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 1), CyTOF विश्लेषण पूरे बीएम से अज्ञात सेल आबादी की खोज करने के लिए, 2), ल्यूकेमिया के रूप में रक्त विकारों के साथ रोगियों के लिए पूरे बीएम दोष की जांच, 3), के अनुकूलन की सहायता फ्लोरोसेंट सक्रिय प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल है कि ताजा पूरे बीएम का उपयोग।

चित्र 1 CyTOF प्रयोगों से एक उदाहरण परिणाम के रूप में प्रस्तुत किया है. इस tSNE साजिश पर कई माउस ऊतकों भर में कोशिकाओं को एक 33-पैरामीटर CyTOF पैनल द्वारा मापा उनकी सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल की समा?...

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Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

न्यूट्रोफिल-लाइनेज सेल के मास साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए पूरे अस्थि मज्जा की तैयारी

यहाँ, हम ताजा अस्थि मज्जा (बीएम) उच्च आयामी द्रव्यमान cytometry के लिए माउस या मानव से अलग प्रक्रिया करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत (समय की उड़ान, CyTOF) न्यूट्रोफिल वंश कोशिकाओं के विश्लेषण द्वारा Cytometry.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

यह बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री प्रोटोकॉल पूरे बोन मैरो की अखंडता को बरकरार रखता है, जिससे अध्ययन किए गए कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए पारंपरिक नमूना तैयारी के दौरान खो गई जानकारी के बचाव की अनुमति होती है। यह तेजी से और सरल अस्थि मज्जा अलगाव प्रोटोकॉल दुर्लभ न्यूट्रोफिल-वंश सबसेट जैसे व्यवहार्य अल्पकालिक माइलॉयड सेल आबादी के अधिग्रहण की सुविधा प्रदान करता है। बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए पहले की सराहना की प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे न्यूट्रोफिल-वंश कोशिकाओं के तहत पहचान करने के लिए रोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए व्यापक निहितार्थ हो सकता है ।यह प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा में मौजूद अल्पकालिक माइलॉयड कोशिकाओं की अखंडता को बरकरार रखता है और आसानी से ठोस ट्यूमर जैसे अन्य ऊतक प्रकारों पर लागू किया जा सकता है। हमने इसे यथासंभव उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाने के लिए प्रोटोकॉल को सरल बनाया है, लेकिन सभी जैविक अध्ययनों में इसे प्रबंधित करने के लिए कुछ अभ्यास रन की आवश्यकता हो सकती है। जब आप यह पहली बार कर रहे हैं, तो आप अपने सभी अभिकर्दकों को पहले तैयार कर सकते हैं और फिर प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन कर सकते हैं।यदि आप किसी भी समस्या का अनुभव करते हैं, तो आप साइटोफोरम से कनेक्ट हो सकते हैं और अन्य साइटोफ उपयोगकर्ताओं से बात कर सकते हैं जो समस्या निवारण में मदद कर सकते हैं। जैविक नमूना तैयारी के लिए, सरल चालें अंतिम परिणाम के साथ एक बड़ा अंतर कर सकती हैं। एक नए उपयोगकर्ता के लिए प्रोटोकॉल को समझने के लिए एक दृश्य प्रदर्शन बहुत आसान है।यदि आप पहली बार ऐसा कर रहे हैं, तो आप अपने अभिकर् ती को पहले तैयार कर सकते हैं और फिर प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन कर सकते हैं। बोन मैरो फसल के लिए, एक बाँझ सर्जिकल पैड पर रीढ़ की स्थिति में एक छह से 10 सप्ताह पुराने C57 काले छह माउस रखें और पेट और पिछले अंगों को स्टरलाइज करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें। पेट की गुहा को खोलने और पिछले अंगों को बेनकाब करने के लिए त्वचा को हटाने के लिए सर्जिकल कैंची विच्छेदन की एक जोड़ी का उपयोग करें।कुंद इत्तला दे दी ड्रेसिंग संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, माउस टिबिया सही टखने के नीचे पकड़ो और कुंद इत्तला दे दी ड्रेसिंग संदंश के नीचे टिबिया को स्थिर करने के लिए घुमावदार ड्रेसिंग संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें । टिबिया को तोड़ने और हड्डी को बेनकाब करने के लिए मांसपेशियों को हटाने के लिए कुंद इत्तला दे दी ड्रेसिंग संदंश का उपयोग करें। ठंड पीबीएस में टिबिया रखने से पहले, स्थिर घुमावदार ड्रेसिंग संदंश को फीमर में ले जाएं और घुटने के जोड़ के नीचे कुंद इत्तला ड्रेसिंग संदंश स्लाइड करें ताकि घुटने की फात पकड़ सके।धीरे-धीरे घुटने को विस्थापित करने के लिए खींचें और फीमर को बेनकाब करने के लिए मांसपेशियों को घुटने से हटा दें। घुमावदार ड्रेसिंग संदंश द्वारा उजागर फीमर पकड़ो और हड्डी के नीचे से फीमर काटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। इसके बाद फीमर को पीबीएस में रखें।इसके बाद, एक 0.5 मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक छेद पंच करने के लिए एक 18 गेज सुई का उपयोग करें और छेद में नीचे की ओर सामना करना पड़ हड्डियों के खुले सिरों के साथ ट्यूब में दोनों हड्डियों जगह है। 0.5 मिलीलीटर ट्यूब को 1.7 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें और डबल लेयर्ड ट्यूब को माइक्रो सेंट्रलाइज में स्पिन करें। अपकेंद्रित्र के अंत में, पुष्टि करें कि बोन मैरो को ट्यूब के नीचे तक निकाला गया है।बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री के लिए बोन मैरो कोशिकाओं को दाग देने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के एक मिलीलीटर में अस्थि मज्जा को फिर से निलंबित करें। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु नली में 70 माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें और कोशिकाओं को ताजा, ठंडे पीबीएस के नौ मिलीलीटर के साथ धोएं।गिनती के लिए ताजा, ठंडे पीबीएस के 10 मिलीलीटर में बोन मैरो सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और छठे सेल एलिकोट को पांच गुना 10 को एक नए 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री स्टेनिंग बफर के एक मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें, 125 नैनोमोलर सिस्प्लैटिन के साथ पूरक। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के बाद, ताजा बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री बफर के चार मिलीलीटर में कोशिकाओं को धोएं।एफसी रिसेप्टर अवरुद्ध समाधान के 50 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के बाद, कोशिकाओं के लिए ब्याज की एंटीबॉडी कॉकटेल के ५० माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे से मिश्रण करने के लिए पिपेट । बोन मैरो कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखने में विभिन्न इनक्यूबेशन चरणों में तापमान बहुत महत्वपूर्ण है।चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के बाद, ताजा बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री बफर प्रति धोने के दो मिलीलीटर में दो बार कोशिकाओं को धोने से पहले ताजा तैयार १.६% के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने से पहले कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए । इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और चार डिग्री सेल्सियस पर एक रात के इनक्यूबेशन के लिए 125 नैनोमोलर इंटरकैलेशन समाधान के साथ पूरक फिक्स्ड पेर बफर के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करने से पहले, ताजा द्रव्यमान साइटोमेट्री स्टेनिंग बफर के दो मिलीलीटर में कोशिकाओं को धोने से पहले धीरे-धीरे भंवर और सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र करें।इसके बाद, कोशिकाओं को प्रति धोने आसुत पानी के एक मिलीलीटर में दो बार धोएं, बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए मास साइटोमेट्री बफर एकाग्रता के प्रति मिलीलीटर के प्रति छठी कोशिकाओं को एक बार 10 पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने से पहले दूसरे धोने के बाद सुपरनेट को ध्यान से एस्पिरेशन करें। इस टी वितरित स्टोचस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग प्लॉट में, कई माउस ऊतकों में कोशिकाओं को 33 पैरामीटर मास साइटोमेट्री पैनल द्वारा मापा गया उनकी सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल की समानता के आधार पर सबसेट में संकुल किया गया था। प्रत्येक कोशिका पर इन मार्कर की अभिव्यक्ति के आधार पर अधिक समान गुणों वाली कोशिकाओं को स्वचालित रूप से एक साथ क्लस्टर किया गया था।इस विधि का उपयोग करके, पूरे अस्थि मज्जा की अखंडता को संरक्षित किया गया था, जिससे पहले से अज्ञात कोशिका आबादी की खोज हुई थी जो एक साथ न्यूट्रोफिल और हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं के हस्ताक्षर सतह मार्कर को सह-व्यक्त करती है। यह सेल आबादी, जिसे पहले माइलॉयड प्रोजेनिटर अध्ययनों में छोड़ दिया गया था, Ly6G सकारात्मक कोशिका की कमी के कारण, सतह मार्कर अभिव्यक्ति का एक अलग पैटर्न प्रदर्शित करता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन आंकड़ों ने Ly6G सकारात्मक सेल क्लस्टर के एक छोटे से सबसेट की खोज की, जो Ly6G को व्यक्त नहीं करता है, लेकिन CD117 सकारात्मक Ly6G सकारात्मक कोशिकाओं के लिए बारीकी से क्लस्टर किया गया था, जो इस मास साइटोमेट्री प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले 33 सतह मार्कर की अभिव्यक्ति के आधार पर न्यूट्रोफिल-वंश के लिए इन कोशिकाओं की समानता का सुझाव देता है।एक 13 रंग फ्लोरोसेंस सक्रिय सेल छंटाई पैनल तो बनाया जा सकता है, डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा न्यूट्रोफिल जनकों के अलगाव की अनुमति । जितनी जल्दी हो सके बोन मैरो आइसोलेशन प्रक्रिया करना महत्वपूर्ण है और धुंधला प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर रखना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

जनरेशन और ट्रैकिंग अध्ययन के लिए Qdot Nanocrystals साथ murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं के लेबल

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भीतर murine aortas Cytometry विश्लेषण फ्लो

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

माउस बृहदांत्रशोथ में इम्यून और गैर प्रतिरक्षा कोशिकाओं से अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण द्वारा जीन एक्सप्रेशन के कार्यात्मक भूमिका फर्क

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग मैक्रोफेज ध्रुवीकरण की जांच

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

अस्थि मैक्रोफेज उत्पादन मज्जा व्युत्पन्न

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

अलगाव और murine अस्थि मज्जा की नसों में इंजेक्शन व्युत्पन्न Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

अस्थि मज्जा पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का रेट्रोवायरल transduction टी सेल रिसेप्टर Retrogenic चूहे उत्पन्न करने के लिए

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

माउस अस्थि मज्जा से Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं की शुद्धि के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Immunophenotype और परिधीय पूरे रक्त में Cytokine उत्पादन का एकल सेल विश्लेषण के माध्यम से मास Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

पूरे रक्त प्रवाह Cytometry विश्लेषण द्वारा मानव Monocyte सबसेट का लक्षण वर्णन

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...