Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Ringraziamo il nucleo di Cytometry LJI Flow per l'assistenza con la procedura di citometria di massa. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01HL134236, P01HL136275 e R01CA202987 (tutte a C.C.H) e ADA7-12-MN-31 (04) (a C.C.H. e Y.P. ) .

Tutti gli esperimenti seguiti hanno approvato le linee guida del La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, e l'approvazione per l'uso dei roditori è stata ottenuta dal La Jolla Institute for Allergy and Immunology secondo i criteri delineati in la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Sanità.
1. Raccoglitore del midollo osseo del mouse (BM)
<ol><li>Acquista topi C57BL/6J da un fornitore commerciale. Nutrire la ...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

Negli ultimi decenni, la citometria di flusso basata sulla fluorescenza è stata utilizzata come metodo principale per studiare le linee cellulari e l'eterogeneità1,2,3. Sebbene la citometria di flusso abbia fornito dati multidimensionali, questo metodo è limitato da scelte di parametri e sovrapposizione spettrale. Per superare la debolezza della citometria di flusso abbiamo approfittato di CyTOF, che utilizza isotopi di metal...

Negli ultimi decenni, i metodi di citometria sono stati un potente strumento per studiare il sistema ematopoietico nel BM. Questi metodi includono la citometria di flusso attivata dalla fluorescenza e il nuovo metodo di CyTOF che utilizza anticorpi con etichettatura di metalli pesanti. Hanno portato a scoperte di molti tipi di cellule in un campione biologico eterogeneo identificando i loro profili unici di espressione dei marcatori di superficie. L'aumento delle sovrapposizioni di spettro associate a più canali porta a una maggiore imprecisione dei dati nelle applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza. Pertanto, le cellule indesiderate vengono regolarmente rimosse al fine di arricchire le popolazioni cellulari di interesse per l'analisi della citometria del flusso attivata dalla fluorescenza. Ad esempio, I marcatori di cellule mieloidi mature, ad esempio Ly6G (o Gr-1) e CD11b, vengono regolarmente rimossi dai campioni BM utilizzando kit di arricchimento magnetico prima dell'analisi della citometria di flusso cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) o combinando questi marcatori in un unico canale cocktail di scarica1,2,3. Un altro esempio è che i neutrofili vengono regolarmente rimossi dai campioni di sangue umano per arricchire le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per gli studi immunologici. Il midollo osseo intero isolato dal topo o dall'uomo, tuttavia, è raramente studiato intatto per l'analisi della citometria.
Recentemente, CyTOF è diventato uno strumento rivoluzionario per studiare il sistema ematopoietico4,5,6. Con CyTOF, gli anticorpi con etichettatura fluoroforo sono sostituiti da anticorpi etichettati come reporter ad elemento pesante. Questo metodo consente la misurazione simultanea di oltre 40 marcatori senza la preoccupazione di sovrapposizione dello spettro. Ha permesso l'analisi di campioni biologici intatti senza passaggi di pre-esaurimento o un canale di scarico. Pertanto, possiamo visualizzare il sistema ematopoietico in modo completo con dimensionalità ad alto contenuto da tradizionali grafici di citometria di flusso 2D. Le popolazioni cellulari omesse in passato durante il processo di deplezione o gating possono ora essere portate alla luce con i dati ad alta dimensione generati da CyTOF4,5. Abbiamo progettato un pannello anticorpale che misura contemporaneamente 39 parametri nel sistema ematopoietico con un focus sul linaggio mieloide7. Rispetto ai dati convenzionali sulla citometria del flusso, l'interpretazione e la visualizzazione dei dati unidimensionali senza precedenti generati da CyTOF è difficile. Scienziati computazionali hanno sviluppato tecniche di riduzione della dimensionalità per la visualizzazione di set di dati ad alta dimensione. In questo articolo è stato utilizzato l'algoritmo viSNE, che utilizza la tecnica t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) per analizzare i dati CyTOF e per presentare il risultato di alta dimensione su una mappa bidimensionale conservando la struttura ad alta dimensione dei dati8,9,10. Nel grafico tSNE, celle simili sono raggruppate in sottoinsiemi e il colore viene utilizzato per evidenziare la caratteristica delle celle. Ad esempio, nella Figura 1 le celle mieloidi vengono distribuite in diversi sottoinsiemi di celle in base alle somiglianze dei relativi modelli di espressione di 33 marcatori di superficie risultanti da CyTOF (Figura 1)4. Qui abbiamo studiato il midollo osseo del topo con il nostro pannello CyTOF di 39 marcatori segnalato in precedenza dall'analisi viSNE7. L'analisi viSNE dei nostri dati CyTOF ha rivelato una popolazionecellulare non identificata che hamostrato caratteristiche sia HSPC (CD117 ) che neutrofili (Ly6G ) (Figura 2)7.
In conclusione, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo intero fresco per l'analisi CyTOF. In questo articolo, abbiamo usato il midollo osseo del topo come esempio, mentre questo protocollo può essere utilizzato anche per elaborare campioni di midollo osseo umano. I dettagli specifici per i campioni di midollo osseo umano sono notati anche nel protocollo. Il vantaggio di questo protocollo è che contiene dettagli come il tempo di incubazione e la temperatura che sono stati ottimizzati per preservare le cellule di lignaggio di neutrofili in tutto il midollo osseo per consentire l'indagine sul midollo osseo intero intatto. Questo protocollo può anche essere facilmente modificato per le applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

In questo articolo, presentiamo un protocollo che è ottimizzato per preservare le cellule di lignaggio neutrofilo in BM fresco per l'intera analisi BM CyTOF. Abbiamo utilizzato un pannello CyTOF a 39 anticorpi di 39 anticorpi mieloidi per valutare il sistema ematopoietico con particolare attenzione alle cellule di linea di neutrofili usando questo protocollo. Il risultato CyTOF è stato analizzato con un algoritmo di riduzione dimensionale delle risorse aperte, viSNE, e i dati sono stati presentati per dimostrare l'esito di questo protocollo. Abbiamo scoperto nuove popolazioni di cellule di lignaggio neutrofia basate su questo protocollo. Questo protocollo di preparazione di BM intero fresco può essere utilizzato per 1), analisi CyTOF per scoprire popolazioni di cellule non identificate da tutta BM, 2), studiando interi difetti BM per i pazienti con disturbi del sangue come la leucemia, 3), assistendo l'ottimizzazione di cicli di citometria di flusso attivati a fluorescenza che utilizzano BM intero fresco.

La figura 1 è presentata come risultato di esempio dagli esperimenti CyTOF. Su questa trama tSNE le cellule su più tessuti del topo sono state raggruppate in sottoinsiemi in base alla somiglianza dei loro profili di espressione dei marcatori di superficie misurati da un pannello CyTOF a 33 parametri. Le cellule con proprietà più simili sono state raggruppate automaticamente, come i neutrofili, i macrofagi o i controller di dominio in base all'espressione dei 33 marcatori su ogni cellula....

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Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

Qui, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo fresco (BM) isolato dal topo o dall'uomo per l'analisi di citometria di massa ad alta dimensione (Cytometria da Time-Of-Flight, CyTOF) delle cellule di filo neutrofilo.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Questo protocollo di citometria di massa preserva l'integrità dell'intero midollo osseo, consentendo il salvataggio delle informazioni che sono state perse durante la preparazione convenzionale del campione per l'analisi di cellule sotto studio. Questo protocollo di isolamento rapido e senza sforzo del midollo osseo facilita l'acquisizione di popolazioni di cellule mieloidi di breve durata come rari sottoinsiemi di lignaggio neutrofilo. L'uso della citometria di massa per identificare le cellule immunitarie precedentemente apprezzate come le cellule di lignaggio neutrofilo può avere ampie implicazioni per un'ampia varietà di malattie.Questo protocollo preserva l'integrità delle cellule mieloidi di breve durata presenti nel midollo osseo e può essere facilmente applicato ad altri tipi di tessuto come il tumore solido. Abbiamo semplificato il protocollo per renderlo il più facile possibile, ma poiché in tutti gli studi biologici potrebbe essere necessario un paio di corse pratiche da gestire. Quando lo fai la prima volta, puoi prima preparare tutti i reagenti e poi seguire rigorosamente il protocollo.In caso di problemi, è possibile connettersi a CyTOForum e parlare con altri utenti CyTOF che possono aiutare a risolvere i problemi. Per la preparazione biologica del campione, semplici trucchi possono fare un'enorme differenza con il risultato finale. Una dimostrazione visiva è molto più facile per un nuovo utente afferrare il protocollo.Se lo stai facendo per la prima volta, puoi prima preparare i reagenti e quindi seguire rigorosamente il protocollo. Per la raccolta del midollo osseo, mettere un topo C57 nero da sei a 10 settimane nella posizione supina su un cuscinetto chirurgico sterile e utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare l'addome e gli arti posteriori. Utilizzare un paio di forbici chirurgiche sezionanti per aprire la cavità addominale e rimuovere la pelle per esporre gli arti posteriori.Usando un paio di forcep di medicazione con punta smussata, tenere la tibia del mouse proprio sotto la caviglia e utilizzare un paio di forcep di medicazione curva per stabilizzare la tibia sotto le forcep di medicazione con punta smussata. Utilizzare le forcep di medicazione con punta smussata per rompere la tibia e rimuovere il muscolo per esporre l'osso. Prima di posizionare la tibia in PBS freddo, spostare le forcep curve stabilizzanti sul femore e far scorrere le forcep di medicazione smussate sotto l'articolazione del ginocchio per tenere la rotula.Tirare delicatamente verso l'alto per dislocare la rotula e rimuovere il muscolo dalla rotula per esporre il femore. Tenere il femore esposto dalle forcep curvo e utilizzare forbici chirurgiche per tagliare il femore dal fondo dell'osso. Quindi posizionare il femore in PBS.Successivamente, utilizzare un ago calibro 18 per fare un buco in un tubo di micro centrifuga da 0,5 millilitri e posizionare entrambe le ossa nel tubo con le estremità aperte delle ossa rivolte verso il basso nel foro. Posizionare il tubo da 0,5 millilitri in un tubo di micro centrifuga da 1,7 millilitri e ruotare i tubi a doppio strato in una micro centrifuga. Al termine della centrifugazione, confermare che il midollo osseo è stato estratto sul fondo del tubo.Per macchiare i globuli ossei per la citometria di massa, sospendere di nuovo il midollo osseo in un millilitro di tampone di lysis dei globuli rossi per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS freddo. Filtrare le celle attraverso un colino di 70 micrometri in un tubo conico da 15 millilitri e lavare le celle con nove millilitri di PBS fresco e freddo.Sospendere di nuovo il pellet di cellule del midollo osseo in 10 millilitri di PBS fresco e freddo per il conteggio e trasferire un'aliquota di cinque volte 10 alla sesta cella in un nuovo tubo da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere nuovamente le cellule in un millilitro di tampone di colorazione citometrica di massa, integrato con 125 cisplatino nanomolare. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule in quattro millilitri di tampone di citometria di massa fresca.Sospendere di nuovo il pellet in 50 microlitri della soluzione di blocco del recettore FC. Dopo 10 minuti a quattro gradi Celsius, aggiungere 50 microlitri del cocktail anticorpale di interesse per le cellule e pipettare delicatamente per mescolare. La temperatura in diversi passaggi di incubazione è molto importante per preservare la vitalità delle cellule del midollo osseo.Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le cellule due volte in due millilitri di tampone di citometria di massa fresca per lavaggio prima di sospendere le cellule in un millilitro di formaldeide all'1,6% preparata al momento per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere nuovamente il pellet in un millilitro di tampone fisso perm integrato con soluzione di intercalazione nanomolare 125 per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Prima di analizzare le cellule per citometria di massa, vortice delicatamente e centrifugare la sospensione cellulare prima di lavare le cellule in due millilitri di tampone di colorazione citometrica di massa fresca.Successivamente, lavare le cellule due volte in un millilitro di acqua distillata per lavaggio, aspirando accuratamente il supernatante dopo il secondo lavaggio prima di sospendere le cellule a una volta da 10 a sesta cellule per millilitro di concentrazione di buffer di citometria di massa per l'analisi della citometria di massa. In questo grafico di incorporamento del vicino stocastico distribuito T, le cellule su più tessuti di topo sono state raggruppate in sottoinsiemi in base alla somiglianza dei loro profili di espressione del marcatore di superficie misurati da un pannello di citometria di massa di 33 parametri. Le celle con proprietà più simili sono state raggruppate automaticamente in base all'espressione di questi marcatori su ogni cella.Utilizzando questo metodo, l'integrità dell'intero midollo osseo è stata preservata, portando alla scoperta di una popolazione cellulare precedentemente sconosciuta che contemporaneamente coesimi neutrofilo ed ematopoietico staminali e cellule progenitrici firmano marcatori di superficie. Questa popolazione cellulare, che è stata precedentemente omessa negli studi sul progenitore mieloide, a causa dell'esaurimento positivo delle cellule Ly6G, mostra un modello distinto di espressione marcatore di superficie. Ancora più importante, questi dati hanno portato alla scoperta di un piccolo sottoinsieme dell'ammasso di cellule positive Ly6G che non esprime Ly6G, ma è stato raggruppato strettamente con le cellule positive Ly6G positive cd117, suggerendo la somiglianza di queste cellule con il lignaggio neutrofilo basato sull'espressione dei 33 marcatori di superficie utilizzati in questo esperimento di citometria di massa.È stato quindi possibile costruire un pannello di smistamento delle celle attivato a 13 colori, consentendo l'isolamento dei progenitori neutrofili mediante citometria a flusso per saggi funzionali a valle. È importante eseguire la procedura di isolamento del midollo osseo il più rapidamente possibile e mantenere le cellule a quattro gradi Celsius durante la procedura di colorazione.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...