Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Vi vil gjerne takke LJI Flow flowcytometri kjerne for å få hjelp med masse flowcytometri prosedyre. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants R01HL134236, P01HL136275, og R01CA202987 (alle til C. C. H) og ADA7-12-MN-31 (04) (til C.C.H. og Y. P. Z).

Alle eksperimenter fulgte godkjente retningslinjer for La Jolla Institute for allergi og immunologi Animal Care og use Committee, og godkjenning for bruk av gnagere ble innhentet fra La Jolla Institute for allergi og immunologi henhold til kriterier skissert i Veiledningen for Stell og bruk av Laboratoriedyr fra National Institutes of Health.
1. høste mus benmarg (BM)
<ol><li>Kjøp C57BL/6J mus fra en kommersiell leverandør. Feed standarden gnager Chow kosthold og hus i microisolator bur i...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

I de siste ti årene, fluorescens Flow flowcytometri ble brukt som den viktigste metoden for å studere mobilnettet linjene og heterogenitet1,2,3. Selv om Flow flowcytometri har gitt multi-dimensjonale data, er denne metoden begrenset av valg av parametre og Spectral overlapping. For å overvinne svakhet flyt flowcytometri vi tok fordel av CyTOF, som bruker heavy metal isotoper i stedet for fluorophores å merke antistoffer som ...

I de siste ti årene har flowcytometri metoder vært et kraftig verktøy for å undersøke blodkreft system i BM. Disse metodene inkluderer fluorescens strømnings flowcytometri og den nye metoden for CyTOF ved bruk av heavy metal-merket antistoffer. De har ført til funn av mange celletyper i en heterogen biologisk prøve ved identifisering av deres unike overflate markør uttrykks profiler. Økt spektrum overlappinger som er forbundet med flere kanaler fører til høyere data unøyaktigheter i fluorescens flyt flowcytometri programmer. Derfor er uønskede celler rutinemessig fjernet for å berike celle populasjoner av interesse for fluorescens-aktivert Flow flowcytometri analyse. For eksempel Ly6G (eller gr-1) og CD11b anses modne myelogen celle markører og Ly6G+ (eller gr-1+) og CD11b+ celler er rutinemessig fjernet fra BM prøver ved hjelp av magnetisk berikelse kits før flyt flowcytometri analyse av blodkreft stem og stamceller (HSPCs) eller ved å kombinere disse markørene i en dump cocktail Channel1,2,3. Et annet eksempel er at nøytrofile er rutinemessig fjernet fra menneskelig Blodprøven å berike perifere blod mononukleære celler (PBMC) for immunologiske studier. Hele benmargen isolert fra mus eller menneskelig, men er sjelden undersøkt intakt for flowcytometri analyse.
Nylig har CyTOF blitt et revolusjonerende verktøy for å undersøke blodkreft system4,5,6. Med CyTOF, er fluoroforen-merket antistoffer erstattet av tunge element reporter-merket antistoffer. Denne metoden gir mulighet for måling av over 40 markører samtidig uten bekymring spektrum overlapping. Den har aktivert analyse av intakt biologisk prøve uten pre-nedbryting trinn eller en dump kanal. Derfor kan vi vise blodkreft system omfattende med høyt innhold dimensionality fra konvensjonelle 2-D Flow flowcytometri tomter. Celle populasjoner utelatt i fortiden under nedbryting eller gating prosessen kan nå bringes i lys med den høye-dimensjonale data generert av CyTOF4,5. Vi har designet et antistoff panel som samtidig måler 39 parametre i blodkreft system med fokus på myelogen linage7. Sammenlignet med den konvensjonelle flyten flowcytometri data, tolkning og visualisering av enestående single-celle høy-dimensjonale data generert av CyTOF er utfordrende. Beregningsorientert forskere har utviklet dimensionality reduksjon teknikker for visualisering av høy-dimensjonale datasett. I denne artikkelen har vi brukt algoritmen, viSNE, som bruker t-distribuert Stokastisk nabo embedding (t-SNE) teknikk for å analysere CyTOF data og presentere den høye-dimensjonale resultatet på en 2-dimensjonal kart samtidig bevaring av høy-dimensjonal struktur av dataene8,9,10. På tSNE-plottet grupperes lignende celler i delsett, og fargen brukes til å utheve funksjonen i cellene. For eksempel, på figur 1 de myelogen cellene er fordelt på flere celle delsett basert på likhetene i deres uttrykk mønstre av 33 overflate markører resulterte fra CyTOF (figur 1)4. Her har vi undersøkt mus benmarg med våre tidligere rapporterte 39-markør CyTOF panel av viSNE analyse7. viSNE analyse av våre CyTOF data avdekket en uidentifisert celle befolkning som viste både HSPC (CD117+) og nøytrofile (Ly6G+) egenskaper (figur 2)7.
Avslutningsvis presenterer vi en protokoll for å behandle friskt hele benmarg for CyTOF analyse. I denne artikkelen har vi brukt mus benmarg som et eksempel, mens denne protokollen kan også brukes til å behandle menneskelige benmarg prøver. Detaljene spesifikke for menneskelige benmarg prøver er også bemerket i protokollen i tillegg. Fordelen med denne protokollen er at den inneholder detaljer som inkubasjonstid og temperatur som var optimalisert for å bevare nøytrofile-avstamning celler i hele benmargen for å muliggjøre etterforskning av intakt hele benmargen. Denne protokollen kan også lett endres for fluorescens-aktiverte Flow flowcytometri applikasjoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

I denne artikkelen presenterer vi en protokoll som er optimalisert for å bevare nøytrofile-avstamning celler i frisk BM for hele BM CyTOF analyse. Vi benyttet en myelogen-partisk 39-antistoff CyTOF panel for å evaluere blodkreft system med fokus på de nøytrofile-avstamning celler ved hjelp av denne protokollen. Den CyTOF resultatet ble analysert med en åpen ressurs-dimensjonal reduksjon algoritme, viSNE, og dataene ble presentert for å demonstrere utfallet av denne protokollen. Vi har oppdaget nye celle populasjoner med nøytrofile avstamning basert på denne protokollen. Denne protokollen av fersk hele BM forberedelse kan brukes for 1), CyTOF analyse for å oppdage uidentifiserte celle populasjoner fra hele BM, 2), gransker hele BM defekter for pasienter med blodsykdommer som leukemi, 3), bistå optimalisering av fluorescens-aktiverte strømnings flowcytometri protokoller som benytter friskt hele BM.

Figur 1 presenteres som et eksempel resultat av CyTOF eksperimenter. På denne tSNE tomten cellene over flere mus vev ble gruppert i delsett basert på likheten av deres overflate markør uttrykk profiler målt ved en 33-parameter CyTOF panel. Celler med flere lignende egenskaper ble automatisk gruppert sammen som nøytrofile, makrofager eller DCs basert på uttrykket for 33 markører på hver celle.
Figur 2 presenteres som et eksempe...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Utarbeidelse av hele benmarg for Mass flowcytometri analyse av nøytrofile-Lineage celler

Her presenterer vi en protokoll for å behandle fersk benmarg (BM) isolert fra mus eller menneske for høy-dimensjonal masse flowcytometri (flowcytometri av Time-of-Flight, CyTOF) analyse av nøytrofile-avstamning celler.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Denne massecytometriprotokollen bevarer integriteten til hele benmargen, slik at redning av informasjonen som gikk tapt under konvensjonell prøveforberedelse for analyse av under studerte celler. Denne raske og uanstrengt benmargsisolasjonsprotokollen forenkler oppkjøpet av levedyktige kortvarige myeloide cellepopulasjoner som sjeldne nøytrofile avstamningsundergrupper. Bruk av massecytometri for å identifisere tidligere under verdsatte immunceller som nøytrofil-avstamning celler kan ha brede implikasjoner for et bredt spekter av sykdommer.Denne protokollen bevarer integriteten til de kortvarige myeloide cellene som er tilstede i benmargen og kan lett brukes på andre vevstyper som den faste svulsten. Vi forenklet protokollen for å gjøre det så brukervennlig som mulig, men som i alle biologiske studier kan det trenge noen praksis går for å administrere. Når du gjør dette første gang, kan du få alle reagensene dine klare først og deretter følge protokollen nøye.Hvis du opplever problemer, kan du koble til CyTOForum og snakke med andre CyTOF-brukere som kan hjelpe til med å feilsøke. For biologisk prøveforberedelse kan enkle triks gjøre en stor forskjell med sluttresultatet. En visuell demonstrasjon er mye enklere for en ny bruker å forstå protokollen.Hvis du gjør dette for første gang, kan du få reagensene klare først og deretter følge protokollen nøye. For benmargshøst, legg en seks til 10 uker gammel C57 svart seks mus i liggende stilling på en steril kirurgisk pute og bruk 70% etanol for å sterilisere magen og baklemmer. Bruk et par dissekering kirurgisk saks for å åpne bukhulen og fjerne huden for å avsløre baklemmer.Ved hjelp av et par stumpe tippet dressing tang, hold musen tibia rett under ankelen og bruk et par buede dressing tang for å stabilisere tibia under stump tippet dressing tang. Bruk de stumpe spisse dressing tang for å bryte tibia og fjerne muskelen for å eksponere beinet. Før du plasserer tibia i kald PBS, flytt de stabiliserende buede dressing tang til lårbenet og skyv de stumpe tippet dressing tang under kneleddet for å holde kneskålen.Trekk forsiktig opp for å forskyv kneskålen og fjern muskelen fra kneskålen for å eksponere lårbenet. Hold den eksponerte lårbenet ved de buede dressing tang og bruk kirurgisk saks for å kutte lårbenet fra bunnen av beinet. Plasser deretter lårbenet i PBS.Deretter bruker du en 18 gauge nål til å slå et hull i en 0,5 milliliter mikro sentrifuge rør og plassere begge bein i røret med de åpne endene av bein vendt nedover i hullet. Plasser 0,5 milliliter røret i et 1,7 milliliter mikro sentrifugerør og spinn de doble lagdelte rørene i en mikrosentridug. På slutten av sentrifugeringen, bekreft at benmargen er ekstrahert til bunnen av røret.For å flekke benmargscellene for massecytometri, re suspendere benmargen i en milliliter rød blodlegemer lysis buffer i 10 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, samle cellene ved sentrifugering og re suspendere pellet i en milliliter kald PBS. Filtrer cellene gjennom en 70 mikrometersil i et konisk rør på 15 milliliter og vask cellene med ni milliliter frisk, kald PBS.Re suspendere benmargscellepellet i 10 milliliter frisk, kald PBS for telling og overføre en fem ganger 10 til sjette celle aliquot inn i en ny 15 milliliter tube. Samle cellene ved sentrifugering og re suspendere cellene i en milliliter masse cytometri farging buffer, supplert med 125 nanomolar cisplatin. Etter fem minutter ved romtemperatur, vask cellene i fire milliliter med fersk massecytometribuffer.Re suspendere pellet i 50 mikroliter av FC reseptor blokkerer løsning. Etter 10 minutter ved fire grader Celsius, tilsett 50 mikroliter av antistoffcocktailen av interesse for cellene og rør forsiktig for å blande. Temperaturen i forskjellige inkubasjonstrinn er svært viktig for å bevare levedyktigheten til benmargscellene.Etter 30 minutter ved fire grader Celsius, vask cellene to ganger i to milliliter fersk masse cytometribuffer per vask før de suspenderer cellene i en milliliter nylaget 1,6% formaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, samle cellene ved sentrifugering og re suspendere pellet i en milliliter fast perm buffer supplert med 125 nanomolar intercalation løsning for en overnatting inkubasjon ved fire grader Celsius. Før du analyserer cellene ved massecytometri, forsiktig vortex og sentrifuge celle suspensjon før du vasker cellene i to milliliter av fersk masse cytometri farging buffer.Deretter vasker cellene to ganger i en milliliter destillert vann per vask, og aspirerer forsiktig supernatanten etter den andre vasken før de suspenderer cellene på en gang 10 til de sjette cellene per milliliter massecytometribufferkonsentrasjon for massecytometrianalyse. I denne T distribuert stokastisk nabo innebygging plottet, cellene over flere musevev ble gruppert i undergrupper basert på likheten av deres overflate markør uttrykk profiler målt ved en 33 parameter masse cytometri panel. Celler med mer lignende egenskaper ble automatisk gruppert sammen basert på uttrykket for disse markørene på hver celle.Ved hjelp av denne metoden ble integriteten til hele benmargen bevart, noe som førte til oppdagelsen av en tidligere ukjent cellepopulasjon som samtidig uttrykker nøytrofile og hematopoetiske stamceller signaturoverflatemarkører. Denne cellepopulasjonen, som tidligere ble utelatt i myeloide stamcellestudier, på grunn av Ly6G positiv celleuttømming, viser et tydelig mønster av overflatemarkøruttrykk. Enda viktigere, disse dataene førte til oppdagelsen av et lite delsett av Ly6G positiv celleklynge som ikke uttrykker Ly6G, men ble gruppert tett til CD117 positive Ly6G positive celler, noe som tyder på likheten av disse cellene til nøytrofil-avstamning basert på uttrykket av 33 overflatemarkører som brukes i denne massecytometri eksperiment.En 13 farge florescence aktivert celle sortering panel kan deretter bygges, slik at isolering av nøytrofile stamfar ved flyt cytometri for nedstrøms funksjonelle analyser. Det er viktig å utføre benmargsisolasjonsprosedyren så raskt som mulig og holde cellene på fire grader Celsius under fargingsprosedyren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Undersøkelse av Macrophage Polarisering Bruk Bone Marrow makrofager som stammer

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-avledet Macrophage Produksjon

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduksjon av stamceller i benmarg for å generere T-celle reseptor Retrogenic Mus

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktivert cellesortering for Rensing av Plasmacytoid dendrittiske celler fra mus Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Én celle analyse av Immunophenotype og cytokin produksjon i eksterne fullblod via masse cytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakteristikk av menneskelig Monocyte delsett av hele blod flyte cytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...