Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить ядро Цитометрии Потока LJI за помощь в процедуре массовой цитометрии. Эта работа была поддержана грантами NIH R01HL134236, P01HL136275 и R01CA202987 (все до C.C.H) и ADA7-12-MN-31 (04) (в C.C.H. и Y.P.).

Все эксперименты следовали утвержденным руководящим принципам Института аллергии и иммунологии Ла Хойя по уходу за животными и использованию комитета, и разрешение на использование грызунов было получено от Института аллергии и иммунологии Ла Хойя в соответствии с критериями, излож?...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

В последние десятилетия цитометрия на основе флуоресценции была использована вкачестве основного метода изучения клеточных линий и неоднородности 1,2,3. Хотя цитометрия потока предоставила многомерные данные, этот метод ограничен выб...

В последние несколько десятилетий, методы цитометрии были мощным инструментом для исследования гематопоетической системы в БМ. Эти методы включают флуоресценцию активированный поток цитометрии и новый метод CyTOF с использованием тяжелых металлов помечены антителами. Они привели к открытиям многих типов клеток в неоднородном биологическом образце, идентифицируя их уникальные профили выражения поверхностных маркеров. Увеличенное перекрытие спектра, связанное с большим количеством каналов, приводит к более высокой неточности данных в приложениях цитометрии с активацией флуоресценции. Таким образом, нежелательные клетки регулярно удаляются для того, чтобы обогатить группы клеток, представляющих интерес для флуоресценции активированный анализ цитометрии потока. Например, Ly6G (или Gr-1) и CD11b считаются зрелыми маркерами миелоидных клеток, а Ly6G (или Gr-1) и CD11b - клетки обычно удаляются из образцов БМ с помощью комплектов магнитного обогащения до анализа цитометрии гематопоитических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) или путем объединения этих маркеров в одном канале свалки коктейль1,2,3. Другим примером является то, что нейтрофилы обычно удаляются из образца крови человека, чтобы обогатить периферические моноядерные клетки крови (PBMC) для иммунологических исследований. Весь костный мозг, изолированный от мыши или человека, однако, редко исследуются нетронутыми для анализа цитометрии.
В последнее время CyTOF стал революционным инструментом дляисследования гематопойтической системы 4,5,6. С CyTOF, флюорофор-маркированные антитела заменены тяжелыми антителами репортер-маркированного элемента. Этот метод позволяет замерить более 40 маркеров одновременно без беспокойства перекрытия спектра. Это позволило провести анализ нетронутых биологических образцов без предистоистой меры или канала свалки. Таким образом, мы можем просматривать гематопоиетическую систему комплексно с высокой объемностью содержания из обычных 2-D потока цитометрии участков. Популяции клеток, опущенные в прошлом во время процесса истощения или gating, теперь могутбыть выведены на свет с помощью высокомерных данных, генерируемых CyTOF 4,5. Мы разработали антителой панели, которая одновременно измеряет 39 параметров в гематопоетической системе с акцентом на миелоидный linage7. По сравнению с обычными данными цитометрии потока, интерпретация и визуализация беспрецедентных одноклеточных высокомерных данных, генерируемых CyTOF, является сложной задачей. Вычислительные ученые разработали методы уменьшения размерности для визуализации высокомерных наборов данных. В этой статье мы использовали алгоритм viSNE, который использует t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) для анализа данных CyTOF и представления высокомерного результата на 2-мерной карте, сохраняя при этом высокомерную структуру данных8,9,10. На участке tSNE похожие ячейки группируются в подмножества, и цвет используется для выделения особенностей ячеек. Например, на рисунке 1 миелоидные клетки распределены по нескольким подмножествам клеток на основе сходства их моделей выражения 33 поверхностных маркеров в результате CyTOF (Рисунок 1)4. Здесь мы исследовали мыши костного мозга с нашими ранее сообщалось 39-маркер CyTOF панели viSNE анализа7. ViSNE анализ наших данных CyTOF показал неопознанную популяцию клеток, которые показали, как HSPC (CD117)и нейтрофил (Ly6G)характеристики (Рисунок 2)7.
В заключение, мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга для анализа CyTOF. В этой статье мы использовали костный мозг мыши в качестве примера, в то время как этот протокол также может быть использован для обработки образцов костного мозга человека. Детали, характерные для образцов костного мозга человека, также отмечены в протоколе. Преимущество этого протокола в том, что он содержит такие детали, как время инкубации и температура, которые были оптимизированы для сохранения нейтрофил-линии клеток в целом костного мозга, чтобы исследование на нетронутыми весь костный мозг. Этот протокол также может быть легко изменен для флуоресценции активированный поток цитометрии приложений.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

В этой статье мы представляем протокол, который оптимизирован для сохранения нейтрофил-линии клеток в свежем БМ для всего анализа BM CyTOF. Мы использовали миелоидно-предвзятый 39-антитела CyTOF панели для оценки гематопоитической системы с акцентом на нейтрофил-линии клеток с помощью этого протокола. Результат CyTOF был проанализирован с помощью алгоритма уменьшения измерения с открытым ресурсом, viSNE, и данные были представлены, чтобы продемонстрировать результаты этого протокола. Мы обнаружили новые популяции нейтрофилов линий клеток на основе этого протокола. Этот протокол свежего целого препарата БМ может быть использован для 1), анализ CyTOF, чтобы обнаружить неопознанные популяции клеток из всего БМ, 2), исследуя целые дефекты БМ для пациентов с заболеваниями крови, такими как лейкемия, 3), помогая оптимизации Флуоресценция активированный поток цитометрии протоколы, которые используют свежий весь БМ.

Рисунок 1 представлен в качестве примера экспериментов CyTOF. На этом участке tSNE клетки через несколько тканей мыши были сгруппированы в подмножества на основе сходства их профилей выражения поверхности маркера, измеренных 33-параметрной панелью CyTOF. Клетки с более похожи?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Подготовка цельного костного мозга для анализа массовой цитометрии нейтрофил-линейных клеток

Здесь мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга (БМ), изолированного от мыши или человека для высокомерной массовой цитометрии (Цитометрия Time-Of-Flight, CyTOF) анализ нейтрофил-линии клеток.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Этот протокол массовой цитометрии сохраняет целостность всего костного мозга, позволяя спасти информацию, которая была утеряна при обычной подготовке образца для анализа изученных клеток. Этот быстрый и легкий протокол изоляции костного мозга облегчает приобретение жизнеспособных недолговечных популяций миелоидных клеток, таких как редкие подмножества нейтрофиловой линии. Использование массовой цитометрии для выявления ранее оцененных иммунных клеток, таких как нейтрофиловые клетки, может иметь широкие последствия для широкого спектра заболеваний.Этот протокол сохраняет целостность недолговечных миелоидных клеток, которые присутствуют в костном мозге и могут быть легко применены к другим типам тканей, таких как твердая опухоль. Мы упростили протокол, чтобы сделать его максимально удобным для пользователей, но, как и во всех биологических исследованиях, для управления им может потребоваться несколько практических запусков. Когда вы делаете это в первый раз, вы можете получить все ваши реагенты готовы, а затем строго следовать протоколу.Если у вас возникли какие-либо проблемы, вы можете подключиться к CyTOForum и поговорить с другими пользователями CyTOF, которые могут помочь в устранении неполадок. Для подготовки биологического образца, простые трюки могут иметь огромное значение с конечный результат. Визуальная демонстрация гораздо проще для нового пользователя, чтобы понять протокол.Если вы делаете это в первый раз, вы можете получить ваши реагенты готовы, а затем строго следовать протоколу. Для сбора костного мозга, место от шести до 10 недель C57 черный шесть мыши в положении на спине на стерильной хирургической площадке и использовать 70% этанола для стерилизации живота и задних конечностей. Используйте пару вскрытия хирургических ножниц, чтобы открыть брюшную полость и удалить кожу, чтобы разоблачить задние конечности.Используя пару тупых наконечником вязки одевания, удерживайте голени мыши прямо под лодыжкой и использовать пару изогнутых вязок одевания для стабилизации голени ниже тупой наконечником вязки одевания. Используйте тупой наконечником одевания миппы сломать голени и удалить мышцы подвергать кости. Перед размещением голени в холодном PBS, переместить стабилизирующую изогнутую повязку миппы на бедренную кость и слайд тупой наконечником вязания типсов ниже коленного сустава, чтобы держать коленную чашечку.Аккуратно подтяните, чтобы вывихнуть коленную чашечку и удалить мышцу из коленной чашечки, чтобы разоблачить бедренную кость. Держите открытые бедренной кости изогнутые вязки одевания и использовать хирургические ножницы, чтобы сократить бедренной кости от нижней части кости. Затем поместите бедренную кость в PBS.Затем используйте 18 калибровочной иглы, чтобы пробить отверстие в 0,5 миллилитров микро центрифуги трубки и место обеих костей в трубку с открытыми концами костей лицом вниз в отверстие. Поместите 0,5 миллилитровую трубку в 1,7 миллилитровую микро центрифугу и вращаем двухслойные трубки в микро центрифуге. В конце центрифугации, подтвердите, что костный мозг был извлечен на дно трубки.Чтобы испачкать клетки костного мозга для массовой цитометрии, повторно приостановить костный мозг в один миллилитр буфера лиза красных кровяных телец в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, собирать клетки центрифугации и повторно приостановить гранулы в один миллилитр холодного PBS. Фильтр клетки через 70 микрометровый ситечко в 15 миллилитров конической трубки и мыть клетки с девятью миллилитров свежих, холодных PBS.Повторно приостановить гранулы клеток костного мозга в 10 миллилитров свежих, холодных PBS для подсчета и передачи пять раз 10 в шестой клеточной aliquot в новую 15 миллилитровую трубку. Соберите клетки путем центрифугации и повторно приостановить клетки в один миллилитр массы цитометрии окрашивания буфера, дополненный 125 наномолярных цисплатин. Через пять минут при комнатной температуре промыть клетки в четыре миллилитра свежей массы цитометрии буфера.Повторно приостанавливайте гранулы в 50 микролитров блокирующего раствора рецепторов FC. Через 10 минут при четырех градусах по Цельсию добавьте 50 микролитров коктейля антител, представляющих интерес для клеток, и аккуратно перемешайте. Температура в различных инкубационых шагов очень важны для сохранения жизнеспособности клеток костного мозга.После 30 минут при четырех градусах по Цельсию, мыть клетки два раза в два миллилитра свежей массы цитометрии буфера на стирку, прежде чем повторно приостановить клетки в один миллилитр свежеприготовленных 1,6%формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, собирать клетки центрифугации и повторно приостановить гранулы в один миллилитр фиксированного буфера завивки дополнен 125 наномолярных интеркаляции раствор для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. Перед анализом клеток по массовой цитометрии, аккуратно вихрь и центрифуга клеточной суспензии перед мытьем клеток в два миллилитров свежей массы цитометрии окрашивания буфера.Далее, мыть клетки два раза в один миллилитр дистиллированной воды на стирку, тщательно аспирации супернатант после второй стирки перед повторной приостановки клеток в один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр массы цитометрии буферной концентрации для массового анализа цитометрии. В этом T распределенных стохастических соседа встраивания участка, клетки через несколько тканей мыши были сгруппированы в подмножества на основе сходства их поверхности маркера выражения профилей, как измеряется 33 параметра массы цитометрии панели. Клетки с более похожими свойствами автоматически группируются на основе выражения этих маркеров на каждой ячейке.Используя этот метод, целостность всего костного мозга была сохранена, что привело к открытию ранее неизвестной популяции клеток, которая одновременно совместно выражает нейтрофил и гематопоэтические стволовые и прародительные клетки подписи поверхностных маркеров. Эта популяция клеток, которая ранее была опущена в исследованиях миелоидных прародителя, из-за положительного истощения клеток Ly6G, демонстрирует четкую картину выражения поверхностного маркера. Что еще более важно, эти данные привели к открытию небольшого подмножества положительного клеточного кластера Ly6G, который не выражает Ly6G, но был сгруппирован близко к CD117 положительные положительные клетки Ly6G, предполагая сходство этих клеток с нейтрофиловой линии на основе выражения 33 поверхностных маркеров, используемых в этом эксперименте массы цитометрии.13 цвет florescence активированной панели сортировки клеток может быть построен, что позволяет изоляции нейтрофила прародителей потока цитометрии для вниз по течению функциональных анализов. Важно выполнить процедуру изоляции костного мозга как можно быстрее и держать клетки на четыре градуса цельсия во время процедуры окрашивания.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Костного мозга, полученных макрофагов производства

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Ретровирусное Трансдукция костного мозга клеток-предшественников для генерации Т-клеточного рецептора Retrogenic Мыши

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Анализ одной ячейки иммунофенотип и производство цитокинов в периферической крови в целом через массовые цитометрии

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...