Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Vi vill tacka LJI Flow flödescytometrianalys kärna för hjälp med massa cytometri förfarande. Detta arbete stöddes av NIH Grants R01HL134236, P01HL136275 och R01CA202987 (alla till C. C. H) och ADA7-12-MN-31 (04) (till C.C.H. och Y. P. Z).

Alla experiment följde godkända rikt linjer från La Jolla Institute for allergi och immunologi djur vård och användning kommittén, och godkännande för användning av gnagare erhölls från La Jolla Institutet för allergi och immunologi enligt de kriterier som anges i hand ledning för skötsel och användning av försöks djur från de nationella hälso instituten.
1. Harvest mus benmärg (BM)
<ol><li>Köp C57BL/6J möss från en kommersiell leverantör. Mata standard gnagare Chow d...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

Under de senaste decennierna användes fluorescensbaserad flödescytometri som den huvudsakliga metoden för att studera cellulära linjer och heterogenitet1,2,3. Även om flödescytometri har tillhandahållit flerdimensionella data, begränsas denna metod av Val av parametrar och spektralöverlappning. För att övervinna svagheten i flödescytometri drog vi fördel av CyTOF, som använder tung metaller isotoper istället för ...

Under de senaste decennierna, cytometri metoder har varit ett kraftfullt verktyg för att undersöka hematopoetiska systemet i BM. Dessa metoder inkluderar fluorescensaktiverad flödescytometri och den nya metoden för CyTOF med hjälp av tunga metallmärkta anti kroppar. De har lett till upptäckter av många cell typer i ett heterogent biologiskt prov genom att identifiera deras unika profiler för ytmärknings uttryck. Ökade spektrum överlappningar som är förknippade med fler kanaler leder till högre data innoggrannhet i Fluorescence-aktiverade flödescytometri applikationer. Därför avlägsnas oönskade celler rutinmässigt för att berika cell populationer av intresse för fluorescens-aktiverade flödescytometri analys. Till exempel, Ly6G (eller gr-1) och CD11b anses mogna myeloida cell markörer och Ly6G+ (eller gr-1+) och CD11b+ celler rutinmässigt avlägsnas från BM prover med hjälp av magnetiska anriknings satser innan flödescytometri analys av hematopoetisk stam och stamceller (hspcs) eller genom att kombinera dessa markörer i en dumpa cocktail kanal1,2,3. Ett annat exempel är att neutrofiler rutinmässigt avlägsnas från humant blod prov för att berika perifera mononukleära blod celler (PBMC) för immunologiska studier. Hela benmärgen isolerad från mus eller människa, emellertid, unders öks sällan intakt för cytometri analys.
Nyligen har cytof blivit ett revolutionerande verktyg för att undersöka det hematopoetiska systemet4,5,6. Med CyTOF ersätts de fluorophore-märkta anti kropparna av tunga element reporter-märkta anti kroppar. Denna metod möjliggör mätning av över 40 markörer samtidigt utan oro spektrum överlappning. Det har möjliggjort analysen av intakt biologiskt prov utan pre-utarmning steg eller en dump kanal. Därför kan vi se hematopoetiska systemet omfattande med hög-innehåll dimensionalitet från konventionella 2-D flödescytometri tomter. Cell populationer som tidigare uteslutits under utarmningen eller gating-processen kan nu föras in i ljuset med de högdimensionella data som genereras av cytof4,5. Vi har utformat en anti kropps panel som samtidigt mäter 39 parametrar i det hematopoetiska systemet med fokus på myeloida radantal7. Jämfört med konventionella flödescytometri-data är tolkningen och visualiseringen av de exempellösa encellig högdimensionella data som genereras av CyTOF utmanande. Computational forskare har utvecklat dimensionalitet reducerings tekniker för visualisering av högdimensionella DataSet. I denna artikel använde vi algoritmen, viSNE, som använder t-Distributed Stochastic granne inbäddning (t-SNE) teknik för att analysera CyTOF data och presentera den höga-dimensionella resultat på en 2-dimensionell karta samtidigt bevara den högdimensionella struktur av data8,9,10. På den tSNE tomt, liknande celler klustrade i under grupper och färgen används för att markera funktionen i cellerna. Till exempel, på bild 1 är de myeloida cellerna fördelade på flera cell grupper baserat på likheter mellan deras uttrycks mönster av 33 ytmarkörer som är resultatet av cytof (figur 1)4. Här undersökte vi mus benmärg med vår tidigare rapporterade 39-markör CyTOF panel av viSNE analys7. viSNE analys av våra CyTOF data avslöjade en oidentifierad cell population som visade både HSPC (CD117+) och neutrofila (Ly6G+) egenskaper (figur 2)7.
Sammanfattnings vis presenterar vi ett protokoll för att behandla färsk hel benmärg för CyTOF-analys. I denna artikel, vi använde mus benmärg som ett exempel, medan detta protokoll kan också användas för att behandla mänskliga benmärgs prov. Även de uppgifter som är specifika för humana benmärgs prov noteras i protokollet. Fördelen med detta protokoll är att den innehåller detaljer såsom inkubations tid och temperatur som optimerats för att bevara neutrofila celler i hela benmärgen för att möjliggöra utredning av intakt hel benmärg. Detta protokoll kan också lätt ändras för fluorescensaktiverade flödescytometri applikationer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

I den här artikeln presenterar vi ett protokoll som är optimerat för att bevara neutrofila-härstamning celler i färska BM för hela BM CyTOF analys. Vi utnyttjade en myeloisk-partisk 39-anti kropp CyTOF panel för att utvärdera hematopoetiska systemet med fokus på neutrofila-Lineage celler med hjälp av detta protokoll. CyTOF resultatet analyserades med en öppen resurs dimensionell minskning algoritm, viSNE, och data presenterades för att demonstrera resultatet av detta protokoll. Vi har upptäckt nya neutrofila-härstamning cell populationer baserat på detta protokoll. Detta protokoll av färskt hela BM beredning kan användas för 1), CyTOF analys för att upptäcka oidentifierade cell populationer från hela BM, 2), undersöker hela BM defekter för patienter med blod sjukdomar såsom leukemi, 3), bistå optimering av fluorescens-aktiverade flödescytometri protokoll som använder färska hela BM.

Figur 1 presenteras som ett exempel resultat från experiment med cytof. På denna tSNE Plot cellerna över flera mus vävnader klustrade i under grupper baserat på likheten mellan deras yta markör uttrycks profiler mätt med en 33-parameter CyTOF panel. Celler med fler liknande egenskaper klustrade automatiskt tillsammans, till exempel neutrofiler, makro Fager eller domänkontrollanter baserat på uttrycket för 33 markörer på varje cell.
<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Beredning av hela benmärgen för Masscytometri analys av neutrofila-Lineage celler

Här presenterar vi ett protokoll för att behandla färsk benmärg (BM) isolerad från mus eller människa för hög-dimensionell Mass cytometri (Cytometri av tid-of-Flight, CyTOF) analys av neutrofila-Lineage celler.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Denna massa cytometri protokoll bevarar integriteten hos hela benmärgen, vilket möjliggör räddning av den information som gick förlorad under konventionella prov beredning för analys av under studerade celler. Denna snabba och ansträngning benmärg isolering protokoll underlättar förvärv av livskraftiga kortlivade myeloisk cell populationer såsom sällsynta neutrofil-härstamning delmängder. Använda masscytometri för att identifiera tidigare under uppskattade immunceller såsom neutrofil-härstamning celler kan ha breda konsekvenser för en mängd olika sjukdomar.Detta protokoll bevarar integriteten hos de kortlivade myeloiska celler som finns i benmärgen och kan lätt appliceras på andra vävnadstyper såsom den fasta tumören. Vi förenklade till protokoll för att göra det så användarvänligt som möjligt, men som i alla biologiska studier kan det behöva några övningskörningar för att hantera. När du gör detta första gången, kan du få alla dina reagenser redo först och sedan strikt följa protokollet.Om du upplever några problem kan du ansluta till CyTOForum och prata med andra CyTOF-användare som kan hjälpa till att felsöka. För biologisk provberedning kan enkla knep göra en enorm skillnad med slutresultatet. En visuell demonstration är mycket lättare för en ny användare att greppa protokollet.Om du gör detta för första gången, kan du få dina reagenser redo först och sedan strikt följa protokollet. För benmärgsskörd, placera en sex till 10 veckor gamla C57 svart sex mus i ryggläge på en steril kirurgisk pad och använda 70%etanol för att sterilisera buken och bakbenen. Använd ett par dissekera kirurgiska sax för att öppna bukhålan och ta bort huden för att exponera bakbenen.Med hjälp av ett par trubbiga tippade dressing tövippor, håll musen skenbenet precis under vristen och använda ett par böjda dressing tövövingar för att stabilisera skenbenet under trubbiga tippade dressing tövövingar. Använd den trubbiga tippade dressing tärna att bryta skenbenet och ta bort muskeln för att exponera benet. Innan skenbenet placeras i kall PBS, flytta stabiliserande böjda förbandstyckor till lårbenet och skjut den trubbiga tippade förbandstövlar under knäleden för att hålla knäskålen.Dra försiktigt upp för att rubba knäskålen och ta bort muskeln från knäskålen för att exponera lårbenet. Håll det exponerade lårbenet i de böjda förbandstärkorna och använd kirurgisk sax för att skära lårbenet från benets botten. Placera sedan lårbenet i PBS.Därefter använder en 18 gauge nål för att slå ett hål i en 0,5 milliliter mikro centrifug röret och placera båda benen i röret med de öppna ändarna av benen nedåt i hålet. Placera 0,5 milliliterröret i ett 1,7 milliliter mikrocentrifugrör och snurra de dubbla skiktade rören i en mikrocentrifug. I slutet av centrifugeringen, bekräfta att benmärgen har extraherats till botten av röret.För att färga benmärgscellerna för masscytometri, åter upphäva benmärgen i en milliliter av röda blodkroppar lys buffert i 10 minuter vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, samla cellerna genom centrifugering och åter upphäva pelleten i en milliliter av kall PBS. Filtrera cellerna genom en 70 mikrometer sil i en 15 milliliter koniskt rör och tvätta cellerna med nio milliliter färska, kalla PBS.Åter upphäva benmärgscell pelleten i 10 milliliter färska, kalla PBS för räkning och överföra en fem gånger 10 till sjätte cellen alikvoten i en ny 15 milliliter rör. Samla in cellerna genom centrifugation och åter upphäva cellerna i en millimeter masscytometri färgning buffert, kompletterad med 125 nanomolar cisplatin. Efter fem minuter i rumstemperatur, tvätta cellerna i fyra milliliter av färsk massa cytometri buffert.Re avbryta pelleten i 50 mikroliter av FC receptorblockeringslösning. Efter 10 minuter vid fyra grader Celsius, tillsätt 50 mikroliter av antikroppscocktail av intresse för cellerna och försiktigt pipet att blanda. Temperaturen i olika inkubation steg är mycket viktigt för att bevara livskraften i benmärgscellerna.Efter 30 minuter vid fyra grader Celsius tvättar du cellerna två gånger i två milliliter färsk masscytometribuffert per tvätt innan cellerna suspenderas i en milliliter nyberedda 1,6%formaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, samla cellerna genom centrifugering och åter upphäva pelleten i en milliliter av fast perm buffert kompletterad med 125 nanomolar intercalation lösning för en övernattning inkubation vid fyra grader Celsius. Innan man analyserar cellerna genom masscytometri, vortex och centrifugcellsupphängningen innan cellerna tvättas i två milliliter av färsk masscytometrifärgningsbuffert.Därefter tvätta cellerna två gånger i en millimeter destillerat vatten per tvätt, försiktigt aspirera supernatanten efter den andra tvätten innan du suspenderar cellerna på en gång 10 till de sjätte cellerna per milliliter masscytometri buffertkoncentration för masscytometrianalys. I detta T distribueras stokastiska granne inbäddning tomt, cellerna över flera mus vävnader var klustrade i delmängder baserat på likheten mellan deras yta markör uttryck profiler mätt med en 33 parameter massa cytometri panel. Celler med mer liknande egenskaper grupperades automatiskt tillsammans baserat på uttrycket av dessa markörer på varje cell.Med hjälp av denna metod, integriteten hos hela benmärgen bevarades, vilket leder till upptäckten av en tidigare okänd cellpopulation som samtidigt co-uttrycker neutrofil och hematopoietic stam och progenitor celler signatur ytmarkörer. Denna cell population, som tidigare utelämnades i myeloisk progenitor studier, på grund av att Ly6G positiva cell utarmning, uppvisar ett distinkt mönster av ytan markör uttryck. Ännu viktigare, dessa data ledde till upptäckten av en liten delmängd av Ly6G positiva cellkluster som inte uttrycker Ly6G, men var klustrade nära cd117 positiva Ly6G positiva celler, vilket tyder på likheten mellan dessa celler till neutrofil-härstamning baserat på uttrycket av de 33 ytmarkörer som används i denna masscytometri experiment.En 13 färg florescence aktiverad cell sortering panel kunde sedan byggas, vilket möjliggör isolering av neutrofila stamfader genom flödescytometri för nedströms funktionella analyser. Det är viktigt att utföra benmärgsisoleringsproceduren så snabbt som möjligt och hålla cellerna vid fyra grader Celsius under färgningsproceduren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generering och märkning av murina härledd från benmärg dendritiska celler med Qdot Nanokristaller för spårning studier

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Utredning av Makrofag Polarisering Använda benmärg makrofager

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Härledd från benmärg Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolering och intravenös injektion av murin benmärg härledda Monocyter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduction av benmärgsstamceller för att generera T-cellreceptor Retrogenic Möss

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescensaktiverad cellsortering för Rening av Plasmacytoid dendritiska celler från benmärg från mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Single-cell analys av Immunophenotype och cytokin produktion i perifera helblod via massa flödescytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering av mänskliga monocyt delmängder av helblod Flow flödescytometri analys

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...