Name: preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Kitle sitometri prosedüründe yardım almak için LJı Flow sitometri çekirdeğine teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma NıH hibe R01HL134236, P01HL136275 ve R01CA202987 (tüm C. C. H) ve ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. ve Y. P. Z) tarafından destekleniyordu.

Tüm deneyler La Jolla alerji ve Immünoloji hayvan bakımı ve kullanım Komitesi için onaylı yönergeler takip ve kemirgenler kullanımı için onay belirtilen kriterlere göre alerji ve Immünoloji için La Jolla Enstitüsü 'nden elde edildi Ulusal Sağlık Enstitüleri 'nden laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kılavuz.
1. hasat fare kemik Iliği (BM)
<ol><li>Ticari bir satıcıdan C57BL/6J fareler satın alın. Mikroizolatör kafeslerinde standart kemirgen Chow d...

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell.">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li><li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow.">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li><li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE.">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li><li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+data+using+t-SNE.">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li><li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).</li><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deep+profiler&#8217;s+guide+to+cytometry.">A deep profiler&#8217;s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).</li><li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+neutrophils.">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li></ol>

Son yıllarda, hücresel sırların ve heterojenlik1,2,3çalışma için ana yöntem olarak floresans bazlı akış sitometri kullanılmıştır. Akış sitometri çok boyutlu veriler sağlasa da, bu yöntem Parametreler ve spektral örtüşme seçenekleriyle sınırlıdır. Akış sitometri zayıflığının üstesinden gelmek için biz, bu nedenle, dedektör kanalları veya hücrelerin otofloresans arasındaki çapraz ortadan ...

Son yıllarda, sitometri yöntemleri BM 'de hematopoetik sistemi araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu yöntemler arasında floresan aktif akış sitometri ve ağır metal etiketli antikorlar kullanarak yeni CyTOF yöntemi yer aldı. Benzersiz yüzey Marker ifade profillerinin tanımlanması ile heterojen bir biyolojik örnekten birçok hücre türünün keşiflerine yol açtı. Daha fazla kanal ile ilişkili olan artan spektrumlu çakışmalar, floresan aktif akış sitometri uygulamalarında daha yüksek veri doğruluğunu sağlar. Bu nedenle, floresan aktif akış sitometri analizi için ilgi hücre nüfusunu zenginleştirmek amacıyla istenmeyen hücreler rutin olarak kaldırılır. Örneğin, Ly6G (veya gr-1) ve CD11b olgun miyeloid hücre işaretçileri olarak kabul edilir ve Ly6G+ (veya gr-1+) ve CD11b+ hücreler rutin olarak BM örneklerinden kaldırılır ve akış sitometri analizinden önce Manyetik Zenginleştirme kitleri kullanılarak hematopoetik kök ve progenitör hücreler (hspcs) veya bir döküm kokteyl kanalı1,2,3bu işaretçileri birleştirerek. Diğer bir örnek ise nötrofiller, immünolojik çalışmalar için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) zenginleştirmek için insan kanı örneğinden rutin olarak kaldırılmalıdır. Tüm kemik iliği fare veya insan izole, ancak, nadiren sitometri analizi için bozulmamış incelenmiştir.
Son zamanlarda, cytof hematopoetik sistemi araştırmak için devrimci bir araç haline gelmiştir4,5,6. CyTOF ile fluorophore etiketli antikorlar ağır eleman muhabiri etiketli antikorlarla değiştirilir. Bu yöntem, spektrum örtüşme endişe olmadan aynı anda 40 üzerinde işaretçileri ölçümü için izin verir. Önceden tükenme adımları veya bir döküm kanalı olmadan bozulmamış biyolojik numunenin analizini sağladı. Bu nedenle, geleneksel 2-b akış sitometri grafiklerden yüksek içerik boyutallık ile hematopoetik sistemi kapsamlı bir şekilde görebilirsiniz. Tükenme veya gating süreci sırasında geçmişte atlanacak hücre nüfusu artık cytof4,5tarafından oluşturulan yüksek boyutlu verilerle ışığa getirilebilir. Hemopoetik sistemde 39 parametreleri aynı anda ölçen bir antikor paneli tasarladık, miyeloid astar7' ye odaklanarak. Geleneksel akış sitometri verilerine kıyasla, CyTOF tarafından oluşturulan eşsiz tek hücreli yüksek boyutlu verilerin yorumlama ve görselleştirilmesi zordur. Hesaplamalı Bilim adamları, yüksek boyutlu veri kümeleri görselleştirme için dimensionality azaltma teknikleri geliştirdik. Bu yazıda, CyTOF verilerini analiz etmek ve yüksek boyutlu yapısı koruyarak 2 boyutlu harita üzerinde yüksek boyutlu sonuç sunmak için t-dağıtılmış Stochastic komşu katıştırma (t-SNE) tekniği kullanır algoritma, viSNE, kullanılan veri8,9,10. TSNE arsa, benzer hücreler alt kümeleri içine kümelenmiş ve renk hücrelerin özelliğini vurgulamak için kullanılır. Örneğin, Şekil 1 ' de miyeloid hücreler, 33 yüzey işaretleyicilerinin ifade desenlerinin benzerliklerini temel alarak birkaç hücre alt setine dağıtılır (Şekil 1)4. Burada daha önce bildirilen 39-Marker CyTOF panel viSNE analiz tarafından fare kemik iliği araştırıldı7. CyTOF verilerimizin viSNE analizi, HSPC (CD117+) ve nötrofil (Ly6G+) özelliklerini (Şekil 2)7gösteren tanımlanamayan bir hücre popülasyonunu ortaya koydu.
Sonuç olarak, CyTOF analizi için taze tüm kemik iliği işlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu yazıda, bir örnek olarak fare kemik iliği kullandık, bu protokol de insan kemik iliği örneklerini işlemek için kullanılabilir iken. İnsan kemik iliği örneklerine özgü detaylar da protokolde belirtilmiştir. Bu protokolün avantajı, tüm kemik iliğinde nötrofil-köklü hücreleri korumak için optimize edilmiş olan inkübasyon süresi ve sıcaklığı gibi ayrıntıları içerdiğinden, tüm kemik iliği üzerinde soruşturma sağlamak. Bu protokol floresans aktif akış sitometri uygulamalarında da kolayca değiştirilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CyTOF Antibodies (mouse)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3089005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3176002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3166004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3148003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3142003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&#945;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3167004B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&#947;RIV) (Clone 9E9)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3146009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3156012B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3159009B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Fc&#949;RI&#945; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3174003B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3169015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 3165018B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse TCR&#946; (Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>(Clone H57-597)-143Nd</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Stabilizer</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>Cat# 130050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin-194Pt</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>Cat# FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>Cat#SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercalator-Ir</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Cat# 201192B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXPAR Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Model: Organism/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock No: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Alogrithm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-based Normalizer</td>
			<td>Finck et al., 2013</td>
			<td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytobank</td>
			<td>Cytobank</td>
			<td>https://www.cytobank.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofkit v1.r.0</td>
			<td>Chen et al., 2016</td>
			<td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-SNE</td>
			<td>van der Maaten and Hinton, 2008</td>
			<td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of whole bone marrow for mass cytometry analysis of neutrophil-lineage cells

Bu makalede, tüm BM CyTOF analizi için taze BM nötrofil-Lineage hücreleri korumak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü kullanarak nötrofil-köklü hücrelere odaklanarak hematopoetik sistemi değerlendirmek için bir myeloid-önyargılı 39-antikor CyTOF panelini kullandık. CyTOF sonucu bir açık kaynak boyutlu azaltma algoritması ile analiz edildi, viSNE, ve veri bu protokol sonucunu göstermek için sunuldu. Bu protokole dayanarak yeni nötrofil-köklü hücre nüfusu keşfettik. Yeni tüm BM hazırlık bu protokol 1 için kullanılabilir), CyTOF Analizi tüm BM 'den tanımlanamayan hücre nüfusu keşfetmek için, 2), lösemi gibi kan bozuklukları olan hastalar için tüm BM kusurlarını araştırmak, 3), optimizasyon yardımcı Yeni tüm BM kullanan floresans aktif akış sitometri protokolleri.

Şekil 1 , CyTOF deneylerinden örnek bir sonuç olarak sunulmuştur. Bu tsne arsa üzerinde birden fazla fare dokularında hücreler bir 33-parametre cytof paneli ile ölçülen kendi yüzey Marker ifade profilleri benzerlik dayalı alt kümeleri içine kümelenmiş. Daha benzer özelliklere sahip hücreler, nötrofiller, makrofajlar veya her hücrede 33 işaretçileri ifadesine dayanan DCs gibi otomatik olarak birlikte kümelenir.
Şekil 2</...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells at JoVE.com

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

Burada, fare veya insan yüksek boyutlu kitle sitometri için izole taze kemik iliği (BM) işlemek için bir protokol sunuyoruz (zaman-of-Flight ile sitometri, CyTOF) nötrofil-köklü hücrelerin analizi.

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Bu kitle sitometri protokolü tüm kemik iliğinin bütünlüğünü koruyarak, incelenen hücrelerin analizi için konvansiyonel numune hazırlama sırasında kaybolan bilgilerin kurtarılmasına olanak sağlar. Bu hızlı ve zahmetsiz kemik iliği izolasyon protokolü, nadir nötrofil-soy alt kümeleri gibi canlı kısa ömürlü miyeloid hücre popülasyonlarının edinimi kolaylaştırır. Nötrofil-soy hücreleri gibi daha önce takdir bağışıklık hücreleri altında tanımlamak için kitle sitometri kullanarak hastalıkların geniş bir yelpazede için geniş etkileri olabilir.Bu protokol kemik iliğinde bulunan ve katı tümör gibi diğer doku tiplerine kolayca uygulanabilen kısa ömürlü miyeloid hücrelerin bütünlüğünü korur. Biz mümkün olduğunca kullanıcı dostu yapmak için protokol basitleştirilmiş, ancak tüm biyolojik çalışmalarda yönetmek için birkaç uygulama çalışır gerekebilir. Bunu ilk kez yaptığınızda, önce tüm reaktiflerinizi hazırlayabilir ve sonra protokolü harfiharfiyle uygulayabilirsiniz.Herhangi bir sorunla karşılaşırsanız, CyTOForum'a bağlanabilir ve sorun gidermeye yardımcı olabilecek diğer CyTOF kullanıcılarıyla konuşabilirsiniz. Biyolojik numune hazırlama için, basit hileler sonuç ile büyük bir fark yaratabilir. Yeni bir kullanıcının protokolü kavraması görsel bir gösteri için çok daha kolaydır.Bunu ilk kez yapıyorsanız, önce reaktiflerinizi hazırlayabilir ve ardından protokolü harfiharfine uygulayabilirsiniz. Kemik iliği hasadı için, altı ila 10 haftalık C57 siyah altı fareyi steril bir cerrahi ped üzerinde supine pozisyonunda yerleştirin ve karın ve arka ekstremiteleri sterilize etmek için %70 etanol kullanın. Karın boşluğu açmak ve arka ekstremiteleri ortaya çıkarmak için deri kaldırmak için diseksiyon cerrahi makas bir çift kullanın.Künt uçlu pansuman forceps bir çift kullanarak, ayak bileği nin hemen altında fare tibia tutun ve künt uçlu pansuman forceps altında tibia stabilize etmek için kavisli pansuman forceps bir çift kullanın. Kaval kemiği kırmak ve kemik ortaya çıkarmak için kas kaldırmak için künt uçlu pansuman forceps kullanın. Tibia soğuk PBS yerleştirmeden önce, femur stabilize kavisli pansuman forceps hareket ettirin ve diz kapağı tutmak için diz eklemi altında künt uçlu pansuman forceps slayt.Yavaşça diz kapağı çıkarmak için yukarı çekin ve uyluk ortaya çıkarmak için diz kapağı kas kaldırmak. Kavisli pansuman forceps tarafından maruz uyluk tutun ve kemik altından femur kesmek için cerrahi makas kullanın. Sonra PBS içinde femur yerleştirin.Daha sonra, 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüp bir delik yumruk ve deliğe aşağı bakan kemiklerin açık uçları ile tüp her iki kemik yerleştirin 18 gauge iğne kullanın. 0,5 mililitrelik tüpü 1,7 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve çift katmanlı tüpleri mikro bir santrifüjde döndürün. Santrifüjün sonunda, kemik iliğinin tüpün altına çıkarıldığını doğrulayın.Kitle sitometri için kemik iliği hücrelerini lekelemek için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kırmızı kan hücre lisis tampon bir mililitre kemik iliği askıya. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve soğuk PBS bir mililitre pelet askıya yeniden. Hücreleri 70 mikrometrelik bir süzgeçten 15 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin ve hücreleri dokuz mililitre taze, soğuk PBS ile yıkayın.Re taze, soğuk PBS 10 mililitre kemik iliği hücre pelet askıya sayım ve yeni bir 15 mililitretüp içine altıncı hücre aliquot beş kez 10 transfer. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve yeniden kitle sitometri boyama tampon bir mililitre hücreleri askıya, ile desteklenen 125 nanomolar sisplatin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, taze kitle sitometri tampon dört mililitre hücreleri yıkayın.FC reseptör engelleme çözeltisinin 50 mikrolitresinde peleti yeniden askıya alın. Dört santigrat derece 10 dakika sonra, hücrelere ilgi antikor kokteyl 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça karıştırmak için pipet. Farklı kuluçka adımlarında sıcaklık kemik iliği hücrelerinin canlılığını korumak için çok önemlidir.Dört santigrat derece 30 dakika sonra, taze hazırlanmış bir mililitre hücreleri askıya almadan önce yıkama başına taze kitle sitometri tampon iki mililitre hücreleri iki kez yıkayın 1.6% formaldehit oda sıcaklığında 15 dakika. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için 125 nanomolar intercalation çözümü ile desteklenen sabit perma tampon bir mililitre pelet askıya. Kitle sitometri ile hücreleri analiz etmeden önce, yavaşça girdap ve taze kitle sitometri boyama tampon iki mililitre hücreleri yıkamadan önce hücre süspansiyon santrifüj.Daha sonra, yıkama başına distile su bir mililitre hücreleri iki kez yıkayın, dikkatle kütle sitometri analizi için kitle sitometri tampon konsantrasyonu mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 hücreleri askıya önce ikinci yıkamadan sonra supernatant aspire. Bu T dağıtılmış stokastik komşu gömme çiziminde, birden çok fare dokuları arasındaki hücreler, 33 parametrelik kütle sitometri paneli ile ölçülen yüzey işaretli ifade profillerinin benzerliğine göre alt kümelere kümelenmiştir. Daha benzer özelliklere sahip hücreler, her hücredeki bu işaretçilerin ifadesine bağlı olarak otomatik olarak bir araya toplanmış.Bu yöntem kullanılarak, tüm kemik iliği bütünlüğü korunmuş, aynı anda nötrofil ve hematopoetik kök ve atatüror hücreleri imza yüzey işaretleri ifade daha önce bilinmeyen bir hücre popülasyonunun keşfine yol açtı. Ly6G pozitif hücre tükenmesi nedeniyle daha önce miyeloid progenitor çalışmalarında atlanan bu hücre popülasyonu, yüzey belirteci ekspresyonunun farklı bir deseni sergilemektedir. Daha da önemlisi, bu veriler Ly6G ifade etmez Ly6G pozitif hücre kümesinin küçük bir alt kümesinin keşfine yol açtı, ancak CD117 pozitif Ly6G pozitif hücrelere yakın kümelenmiş, bu hücrelerin nötrofil-soy bu kitle sitometri deneyinde kullanılan 33 yüzey belirteçleri ifade dayalı benzerlik düşündürmektedir.Bir 13 renk floresan aktif hücre sıralama paneli sonra inşa edilebilir, downstream fonksiyonel tahliller için akış sitometri tarafından nötrofil atalarının izolasyon sağlayan. Kemik iliği izolasyon işlemini mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirmek ve boyama işlemi sırasında hücreleri dört derecede tutmak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...