Name: in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

Het project werd gefinancierd door de nationale instituten van gezondheid (AI128406 www.nih.gov) aan ZY en gedeeltelijk door het onderzoekscentrum van de kanker van Johnson (http://cancer.k-state.edu) in de vorm van gediplomeerde student de zomer toelage aan PD.

1. voorbereiding van DNA-Template door PCR voor in vitro transcriptie
<ol><li>Om het malplaatje van DNA door PCR voor te bereiden, ontwerp inleidingen. Bij het ontwerpen van primers overwegen cruciale kenmerken zoals primer lengte, gloeien temperatuur (Tm), GC-inhoud, 3 ' eindigen met G of C, enz. Opmerking: Uitvoerig besproken in deze literatuur25,26,27.</li>
	<li>De inleidinge...

<ol>
	<li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+protein+synthesis.">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Dogma+of+Molecular+Biology.">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes:+Mechanisms+and+Biological+Targets.">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress.">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li><li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).</li><li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes.">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li><li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+Translation:+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells.">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).</li><li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+against+the+Tide:+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff.">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li><li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5&#8217;+noncoding+region.">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5&#8217; noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li><li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA.">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li><li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3&#8242;+or+the+5&#8242;+untranslated+region.">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3&#8242; or the 5&#8242; untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li><li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3&#8242;+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses.">3&#8242; Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li><li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+poly(A)+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES.">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li><li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response.">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li><li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+poly(A)+leaders+of+variable+lengths+at+the+5&#8217;+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs.">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5&#8217; ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li><li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5&#8217;+poly(A)+leader+on+its+early+transcript.">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5&#8217; poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li><li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5&#8242;+poly(A)+leader.">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5&#8242; poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li><li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+initiation+and+3&#8242;+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs.">Pervasive initiation and 3&#8242; end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li><li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5&#8217;-poly(A)+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation.">The 5&#8217;-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase.">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li><li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff.">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li><li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors.">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23 (2005).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing.">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+the+5&#8242;+and+3&#8242;+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts.">Genome-Wide Analysis of the 5&#8242; and 3&#8242; Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li><li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).</li><li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter.">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li><li>Thornton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+by+Overlap+Extension+PCR+to+Obtain+Hybrid+DNA+Products.">Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products.</a> The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).</li><li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II&#8211;associated+methyltransferase.">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II&#8211;associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li><li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific,+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase.">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li><li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome.">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862 (2018).</li><li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation.">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+m6A,+m6Am,+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm.">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li></ol>

Alle vier-kern stappen zijn essentieel voor het succes van de in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay. Speciale aandacht dient te worden besteed aan Primer design, met name voor de "propromotor" sequentie. De polymerase van RNA van 5' begint transcriptie van de onderstreepte eerste G (gGG-UTR-aug-) in de promotor van de voor de 5 '-UTR opeenvolging toegevoegd. Hoewel de transcriptie Startsite (TSS) begint vanaf de eerste G aan de 5 ' einde, het verminderen van het aantal van G minder dan drie...

Volgens het centrale dogma, de genetische informatiestromen van DNA aan RNA en dan tenslotte aan proteïne1,2. Deze stroom van genetische informatie is hoogst geregeld op vele niveaus met inbegrip van mRNA vertaling3,4. Ontwikkeling van verslaggever assays om regulering van genexpressie te meten zal het begrijpen van de regelgevende mechanismen die betrokken zijn bij dit proces te vergemakkelijken. Hier beschrijven wij een protocol om mRNA vertaling te bestuderen gebruikend een in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde Luciferase verslaggever assay in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen.
Poxviruses bestaat uit vele zeer gevaarlijke menselijke en dierlijke pathogenen5. Net als alle andere virussen, poxviruses uitsluitend beroepen op host Cell machines voor de eiwitsynthese6,7,8. Om efficiënt te synthetiseren virale eiwitten, virussen geëvolueerd vele strategieën om mobiele translationele machines te kapen om het te omleiden voor de vertaling van virale mRNAs7,8. Een algemeen werkend mechanisme door virussen is het gebruik van CIS-Acting elementen in hun transcripten. Bekende voorbeelden zijn de interne ribosoom entry site (IRES) en Cap-Independent Translation Enhancer (cite)9,10,11. Deze CIS-elementen maken de virale transcripten een translationeel voordeel door het aantrekken van translationele machines via diverse mechanismen12,13,14. Meer dan 100 familie pokkenvirus mRNAs heeft een evolutionair behouden CIS-handelend element in 5 '-onvertaald gebied (5 '-UTR): een 5 '-poly (a) leider bij de zeer 5 ' einden van deze mRNAs15,16. De lengtes van deze 5 '-poly (a) leiders zijn heterogeen en door ontsporing van de familie pokkenvirus-gecodeerde polymerase van RNA tijdens transcriptie17,18geproduceerd. Wij, en anderen, ontdekten onlangs dat de 5 '-poly (a) leider een Vertaal voordeel aan mRNA in cellen verleent die met Vaccinia virus (VACV) worden besmet, het prototypic lid van poxviruses19,20.
De in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay werd in eerste instantie ontwikkeld om de rol van 5 '-poly (a) leider in mRNA vertaling te begrijpen tijdens familie pokkenvirus infectie19,21. Hoewel de plasmide op DNA-gebaseerde Luciferase verslaggever analyses wijd zijn gebruikt, zijn er verscheidene nadelen die de resultaat interpretatie in familie pokkenvirus-besmette cellen zullen compliceren. Eerst, kunnen de plasmiden in VACV-besmette cellen repliceren22. Ten tweede, cryptische transcriptie komt vaak uit plasmide DNA18,23,24. Ten derde, VACV promotor-gedreven transcriptie genereert poly (A)-leider van heterogene lengtes waardoor het moeilijk is om de poly (A)-Leader lengte controle in sommige experimenten18. Een in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay omzeilt deze kwesties en de gegevensinterpretatie is eenvoudig.
Er zijn vier belangrijke stappen in deze methode: (1) de Kettingreactie van de polymerase (PCR) om het malplaatje van DNA voor in-vitro transcriptie te produceren; (2) in-vitro transcriptie voor het genereren van mRNA; (3) transfectie om mRNA in cellen te leveren; en (4) detectie van Luciferase activiteit als indicator van de vertaling (Figuur 1). Resulterende PCR amplicon bevat de volgende elementen in 5 ' aan 3 ' richting: de-promotor, poly (A) leider of gewenste 5 '-UTR opeenvolging, Firefly Luciferase open lezings kader (ORF) gevolgd door een poly (A) staart. PCR amplicon wordt gebruikt als malplaatje om mRNA door in-vitro transcriptie te synthetiseren gebruikend de polymerase van tempels. Tijdens in vitro transcriptie, m7G GLB of andere GLB Analog is opgenomen in nieuw gesynthetiseerde mRNA. De afgetopte transcripten zijn transfected in niet-geïnfecteerde of VACV-geïnfecteerde cellen. De cel lysate wordt verzameld op de gewenste tijd na transfectie om Luciferase activiteiten te meten die op eiwitproductie van transfected mRNA wijzen. Deze verslaggever analyse kan worden gebruikt om Vertaal regelgeving door CIS-element te bestuderen aanwezig in 5 '-UTR, 3 '-UTR of andere gebieden van mRNA. Voorts kan de in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde analyse worden gebruikt om verschillende mechanismen van Vertaal initiatie met inbegrip van GLB-afhankelijke initiatie, GLB-onafhankelijke initiatie, re-initiatie en interne initiatie zoals IRES te bestuderen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492</td>
			<td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td>Anti reverse Cap analog or ARCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3693</td>
			<td>Opaque walled 96 well white plate with solid bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td>
			<td>OMEGA BIO-TEK</td>
			<td>D6492</td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM2010</td>
			<td>Referred as multimode plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td>In-Vitro transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Used to measure DNA and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080</td>
			<td>Capping system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells

Elke familie pokkenvirus mRNA die na virale replicatie van DNA wordt getranscribeerd heeft een evolutionair behouden, niet-malplaatjed 5 '-poly (A) leider in 5 '-UTR. Om de rol van 5 '-poly (A) leider in mRNA vertaling tijdens familie pokkenvirus besmetting te ontleden ontwikkelden wij een in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay. Deze reporter assay bestaat uit vier kern stappen: (1) PCR om de DNA-template voor in vitro transcriptie te versterken; (2) transcriptie in vitro om mRNA te produceren gebruikend de polymerase van RNA (3) transfectie om in vitro getranscribeerd mRNA in cellen te introduceren; (4) detectie van Luciferase activiteit als indicator van de vertaling. De RNA-based Luciferase reporter assay beschreven hier omzeilt kwesties van plasmide replicatie in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen en cryptische transcriptie van de plasmide. Dit protocol kan worden gebruikt om Vertaal regelgeving door CIS-elementen in een mRNA met inbegrip van 5 '-UTR en 3 '-UTR in andere systemen dan familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen te bepalen. Bovendien kunnen verschillende vormen van vertaling initiatie zoals Cap-afhankelijke, Cap-onafhankelijke, re-initiatie, en interne initiatie worden onderzocht met behulp van deze methode.

De vier stappen van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay: PCR voor het genereren van DNA-sjabloon voor in vitro transcriptie, in vitro transcriptie te genereren mRNA, mRNA transfectie, en Luciferase meting, kan worden gezien in het schematische diagram ( Figuur 1). Het ontwerpen van inleidingen voor beide malplaatjes van DNA (Fluc en Rluc) en het algemene schema van de uitbreiding PCR van de overhang wordt geïllustreerd in het schemat...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

We presenteren een protocol om mRNA vertaling verordening in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen met behulp van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay studie. De analyse kan voor het bestuderen van Vertaal regelgeving door CIS-elementen van een mRNA worden gebruikt, met inbegrip van 5 '-onvertaalde regio (Utr) en 3 '-UTR. Verschillende Vertaal initiatie modi kunnen ook worden onderzocht met behulp van deze methode.

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Ons protocol voor een in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde luciferase test helpt bij het bestuderen van vertaalregulatie in pokkenvirus geïnfecteerde cellen. Bovendien maakt een aangepaste lengte van de Poly(A)-liter het mogelijk om de regulerende effecten op de vertaling te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor de studie van de vertaalregulatie door Cis-elementen zoals 5'UTR en 3'UTR in mRNA en breed spectrum van vertaalinitiatie.De in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde luciferase reporter test kan worden aangepast aan modificatie aan cap en andere modificatie op te nemen en gebruikt om het effect op de vertaling te testen. Om te beginnen, ontwerp naar voren en omgekeerde primers om PCR amplicon te genereren met de volgende elementen in 5'to 3'direction:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF in een Poly (A)tail aangeduid als T7_12A-Fluc, omvatten een aantal extra nucleotiden in voorwaartse primer, gevolgd door T7-Promotor Poly (A)liter of gewenste 5'UTR sequentie en ongeveer 20 nucleotiden die overeenkomen met de 5'end van de off van het reportergen. Pas de primerlengte aan op basis van de smelttemperatuur die overeenkomt met de 5'end van de ORF van het reportergen, zodat het overeenkomstige gebied in de primer identiek is aan de zinstreng van het gen.Ontwerp vervolgens omgekeerde primer om Poly(A)tail en ongeveer 20 nucleotiden op te nemen. Pas aan op basis van de smelttemperatuur die overeenkomt met de 3'end van de ORF van het reportergen, zodat het overeenkomstige gebied van de primer identiek is aan de antisense streng van het gen en een in-frame stop codon aanwezig is voor de Poly(A)staart. Voor interne controle, ontwerp een andere reeks primers met de volgende elementen in 5'to 3'direction:T7-Promoter, een willekeurige 5'UTR codering sequentie met Kozak sequentie, Renilla Luciferase ORF, en Poly (A) staart, aangeduid als T7_Kozak-Rluc.Om de reactie in te stellen, voeg reagentia in de volgende volgorde toe aan een PCR-buis: DNase vrij water, 2X high-fidelity DNA polymerase, primers en sequentie bevestigd luciferase template DNA. Na een standaard drie-staps PCR-cyclus om een DNA-sjabloon te genereren, detecteert u het PCR-product door 5-10% van de PCR-reactie uit te voeren in een 1%agarose TAE gel elektroforese samen met een moleculaire gewichtsnorm. Visualiseer de gel onder een UV-verlichting om de grootte van het PCR-product te bepalen.Na het bepalen van de juiste grootte van het PCR-product, zuiveren met behulp van een commercieel verkrijgde PCR zuivering kit met behulp van 100 microliters van nuclease gratis water om het DNA te ontlenen. Controleer de concentratie van het gezuiverde DNA met behulp van een spectrofotometer en bewaar deze op min 20 graden Celsius voor gebruik voor in vitro transcriptie onmiddellijk. Om RNA uit het PCR-product te synthetiseren, voegt u de volgende reagentia toe aan een microcentrifugebuis: DNase-RNase gratis water, NTP-buffermix, capanaloog, PCR-productsjabloon en T7-RNA polymerasemix van in vitro transcriptiekit.Meng. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende twee uur en ga dan over tot de zuivering van de gesynthetiseerde RNA met behulp van een RNA zuivering kit. Om het gezuiverde RNA te controleren, verwarmt u RNA gedurende vijf minuten op 70 graden om de secundaire structuur te verwijderen en op 1,5 agarose TBE-gel uit te voeren.Visualiseer vervolgens de gel onder een UV-verlichting. Controleer de concentratie van het gezuiverde RNA met behulp van een spectrofotometer. Aliquot het en op te slaan op min 80 graden Celsius.Seed HeLa cellen in een 24 put plaat tot 80-90% samenvloeiing te bereiken de volgende dag en 's nachts in een incubator in te broeden op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Infecteer HeLa-cellen met het Vaccinia-virus bij een veelheid aan infectie van vijf en houd niet-geïnfecteerde HeLa-cellen ter vergelijking. Vervolgens incubeer de plaat op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide voor 10 tot 12 uur.Na de gewenste uren na infectie, meng 480 nanogram van 12A sequentie met Firefly Luciferase mRNA en 20 nanogram van Kozak sequentie met Renilla Luciferase mRNA in een microcentrifuge buis. In een andere microcentrifuge buis, voeg 1,1 microliter van kationische lipide transfectie reagens. Voeg 55 microliter verlaagde serummedia toe aan beide buizen, meng en broed vijf minuten op kamertemperatuur.Voeg vervolgens 55 microliter cationic lipide transfection reagens met verminderde serummedia toe aan mRNA met buis. Meng voorzichtig maar grondig met een pipet en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Verwijder tijdens de incubatie het celkweekmedium uit de cellen en voeg 400 microliter met verlaagd serummedium per put toe.Wanneer incubatie is voltooid, voeg 100 microliters van het mengsel drop verstandig en gelijkmatig per put van de 24 put plaat. Vijf uur na co-transfectie met 12A Fluc en Kozak Rluc mRNA, verwijder het verlaagde serummedium uit de cellen en lyse de cellen door het toevoegen van 150 microliters 1X lyse buffer van de Luciferase test kit geschikt voor het uitvoeren van twee reporter testen. Schraap na 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur de cellen met rubber en steriele spuit en breng deze over naar een microcentrifugebuis.Om celpuin te pellen, centrifugeer het lysaat op 12.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng 30 microliter supernatant per put van een ondoorzichtige ommuurde 96 goed witte testplaat met een stevige bodem. Gebruik de Luciferase-testkit en een multi-mode plaatlezer luminometer om de dubbele luminescentie te meten met behulp van kinetiekfunctie zoals beschreven in het manuscript.Na het exporteren van de luminescentieleesgegevens in een wenselijk bestandsformaat, bepaal je de relatieve vertaalsnelheid van 12A Fluc mRNA in niet-geïnfecteerde en MET VACV geïnfecteerde HeLA-cellen door fluc-waarde te delen door de waarde van interne controle Rluc. Deze test werd gebruikt om de vertaalefficiëntie van een Fluc mRNA te testen die een 5'Poly(A)liter bevat in niet-geïnfecteerde en VACV geïnfecteerde cellen. Zowel niet-geïnfecteerde en VACV geïnfecteerde cellen werden met succes mede-transfected met Fluc en Rluc mRNA.Het delen van Fluc door Rluc normaliseerde de transfectie-efficiëntie in RNA-stabiliteit in cellen. 5'Poly(A)liter met mRNA heeft een translationeel voordeel tijdens VACV-infectie in vergelijking met niet-geïnfecteerde cellen. Dit was niet te wijten aan differentiële transfectie efficiëntie of mRNA stabiliteit als het RNA-niveau was vergelijkbaar in niet-geïnfecteerde en VACV geïnfecteerde cellen vijf uur na mRNA transfectie.Wees extra voorzichtig bij het ontwerpen van primers, omdat dit niet alleen de efficiëntie van de PCR-reactie kan beïnvloeden, maar ook alle downstreamprocessen die het versterkte DNA vereisen. Deze methode is een belangrijke test om de vertaalverordening snel te testen op Cis-elementen. Indien mogelijk moet deze methode worden bevestigd door andere aanvullende experimenten.Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het gebruik van het Vaccinia-virus en blootstelling aan chemische stoffen zoals ethidiumbromide en fenol voorkomen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro assay van bacteriële hechting op zoogdieren epitheelcellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...