Name: in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

このプロジェクトは、国立衛生研究所 (AI128406 www.nih.gov) が ZY に、また一部はジョンソンがん研究センター (http://cancer.k-state.edu) によって、大学院生の夏期給付の形で PD に資金を提供されました。

1. PCR による In Vitro転写用 DNA テンプレートの作成
<ol><li>PCR によって DNA テンプレートを調製するために、設計プライマー。プライマーの設計に際しては、プライマー長、アニーリング温度 (Tm)、GC 含有量、G や C などの 3 ' 末端などの重要な特性を考慮してください。 注:これらの文献25、26、<sup class="xref...

<ol>
	<li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+protein+synthesis.">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Dogma+of+Molecular+Biology.">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes:+Mechanisms+and+Biological+Targets.">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress.">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li><li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).</li><li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes.">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li><li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+Translation:+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells.">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).</li><li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+against+the+Tide:+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff.">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li><li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5&#8217;+noncoding+region.">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5&#8217; noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li><li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA.">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li><li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3&#8242;+or+the+5&#8242;+untranslated+region.">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3&#8242; or the 5&#8242; untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li><li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3&#8242;+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses.">3&#8242; Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li><li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+poly(A)+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES.">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li><li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response.">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li><li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+poly(A)+leaders+of+variable+lengths+at+the+5&#8217;+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs.">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5&#8217; ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li><li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5&#8217;+poly(A)+leader+on+its+early+transcript.">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5&#8217; poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li><li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5&#8242;+poly(A)+leader.">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5&#8242; poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li><li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+initiation+and+3&#8242;+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs.">Pervasive initiation and 3&#8242; end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li><li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5&#8217;-poly(A)+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation.">The 5&#8217;-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase.">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li><li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff.">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li><li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors.">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23 (2005).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing.">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+the+5&#8242;+and+3&#8242;+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts.">Genome-Wide Analysis of the 5&#8242; and 3&#8242; Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li><li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).</li><li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter.">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li><li>Thornton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+by+Overlap+Extension+PCR+to+Obtain+Hybrid+DNA+Products.">Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products.</a> The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).</li><li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II&#8211;associated+methyltransferase.">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II&#8211;associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li><li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-specific,+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase.">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li><li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome.">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862 (2018).</li><li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation.">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+m6A,+m6Am,+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm.">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li></ol>

全ての4コアステップは、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイの成功にとって重要である。プライマーの設計、特に T7 プロモーター配列には特別な注意が払われるべきである。T7 RNA ポリメラーゼは、5 '-UTR 配列の前に追加された T7 プロモーターにおいて下線が付いた最初の G (gGG-5'-UTR-AUG-) からの転写を開始する。転写開始部位 (TSS) は、5 ' 末端で最初の G ?...

セントラルドグマによると、遺伝情報は DNA から RNA へ、そして最終的にタンパク質1,2に流れます。この遺伝情報の流れは、mRNA 翻訳3,4を含む多くのレベルで高度に調節されている。遺伝子発現の調節を測定するレポーターアッセイの開発は、このプロセスに関与する規制メカニズムの理解を容易にします。ここでは、ポックスウイルスに感染した細胞において、in vitro 転写 RNA ベースのルシフェラーゼを用いた mRNA 翻訳を研究するためのプロトコールについて述べる。
ポックスウイルスは、多くの非常に危険なヒトおよび動物病原体5を含む。他のすべてのウイルスと同様に、ポックスウイルスはタンパク質合成6、7、8のための宿主細胞機械に独占的に依存しています。ウイルスは、ウイルスタンパク質を効率的に合成するために、ウイルス mRNAs7,8の翻訳にリダイレクトするために細胞翻訳機械をハイジャックする多くの戦略を進化させました。ウイルスによって一般的に採用されているメカニズムの1つは、 cisの作用する要素をトランスクリプトに使用することです。顕著な例には、内部リボソーム進入部位 (IRES) およびキャップ非依存性翻訳促進剤 (引用)9、10、11が含まれる。これらのシス元素は、ウイルス転写物を多様なメカニズム12,13,14を介して翻訳機械を誘致することによって翻訳優位にレンダリングする。100以上のポックスウイルス mRNAs は、5 '-非翻訳領域 (5 '-UTR) において進化的に保存されたシス作用素子を有する: これらの mRNAs15,16の非常に 5 ' 末端の 5 '-ポリ (a) リーダー。これらの 5 '-ポリ (A) リーダーの長さは不均一であり、転写17,18の間にポックスウイルスで符号化された RNA ポリメラーゼの滑りによって生成される。我々、および他の人は、最近、5 '-ポリ (A) リーダーがワクシニアウイルス (VACV) に感染した細胞の mRNA に翻訳優位を与えることを発見し、ポックスウイルス19,20のプロトタイプメンバーである。
In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染19,21の間の mRNA 翻訳における 5 '-ポリ (A) リーダーの役割を理解するために最初に発達しました。プラスミド DNA 系ルシフェラーゼのレポーターアッセイは広く使用されていますが、ポックスウイルスに感染した細胞では結果の解釈が複雑になる欠点がいくつかあります。まず、プラスミドは、VACV 感染細胞22で複製することができる。第2に、不可解な転写は、しばしばプラスミド DNA18、23、24から生じる。第3に、VACV プロモーター駆動転写は、不均一な長さのポリ (A) −リーダーを生成し、その結果、いくつかの実験18においてポリ (a) −リーダーの長さを制御することを困難にする。インビトロ転写された RNA ベースのルシフェラーゼは、これらの問題を回避し、データの解釈は簡単です。
この方法には、(1) ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の4つの主要なステップがあり、in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成します。(2) mRNA を生成するインビトロ転写;(3) 細胞内に mRNA を送達するトランスフェクションおよび (4) 変換の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出 (図 1)。得られた PCR アンプリコンは、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の元素を含有する: T7 プロモーター、ポリ (A) リーダー、または所望の 5 '-UTR 配列は、ホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレーム (ORF) に続いて、ポリ (A) テールを有する。PCR アンプリコンは、T7 ポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって mRNA を合成する鋳型として使用される。In vitro 転写の間、m7G キャップまたは他のキャップアナログは、新たに合成された mRNA に組み込まれる。証明された転写物は未感染または VACV 感染細胞にトランスフェクトします。.細胞溶解物をトランスフェクション後の所望の時間に収集し、トランスフェクトされた mRNA からのタンパク質産生を示すルシフェラーゼ活性を測定します。このレポーターアッセイは、5 '-UTR、3 '-UTR、またはその他の mRNA の領域に存在するシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。さらに、in vitro 転写された RNA ベースのアッセイは、キャップ依存性の開始、キャップ非依存の開始、再開始および IRES のような内部開始を含む翻訳開始の異なるメカニズムを研究するために使用することができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492</td>
			<td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td>Anti reverse Cap analog or ARCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3693</td>
			<td>Opaque walled 96 well white plate with solid bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td>
			<td>OMEGA BIO-TEK</td>
			<td>D6492</td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM2010</td>
			<td>Referred as multimode plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td>In-Vitro transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Used to measure DNA and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080</td>
			<td>Capping system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells

ウイルス DNA 複製後に転写されるすべてのポックスウイルス mRNA は、5 '-UTR において進化的に保存された、非テンプレート 5 '-ポリ (A) リーダーを有する。ポックスウイルス感染時の mRNA 翻訳における 5 ' ポリ (A) リーダーの役割を分析するために、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイを開発しました。このレポーターアッセイは、4つのコアステップで構成されています:(1) PCR 法転写のための DNA テンプレートを増幅します。(2) T7 RNA ポリメラーゼを用いて mRNA を生成する in vitro 転写;(3) インビトロで転写した mRNA を細胞内に導入するトランスフェクション。(4) 翻訳の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出ここで説明した RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染細胞におけるプラスミド複製の問題と、プラスミドからの不可解な転写を回避します。このプロトコルは、ポックスウイルス感染細胞以外の系で 5 '-UTR および 3 '-UTR を含む mRNA 中のシス要素による翻訳調節を決定するために用いることができる。さらに、この方法を使用して、キャップ依存性、キャップ非依存、再開始、および内部開始などのさまざまな変換開始モードを調べることができます。

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼの4つのステップは、レポーターアッセイ: in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成するために、インビトロで、mRNA を生成する転写、mRNA トランスフェクション、およびルシフェラーゼ測定、スケマティックダイアグラムで見ることができます (図 1)。DNA テンプレート (Fluc および Rluc) の両方のた...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼを使用してポックスウイルスに感染した細胞で mRNA 翻訳調節を研究するためのプロトコールを提示します。このアッセイは、5 '-非翻訳領域 (UTR) および 3 '-UTR を含む、mRNA のシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。この方法を使用して、異なる翻訳開始モードを調べることもできます。

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

インビトロ転写RNAベースのルシファーゼアッセイのプロトコルは、ポックスウイルス感染細胞の翻訳調節を研究するのに役立ちます。さらに、ポリ(A)リットルのカスタマイズされた長さは、翻訳に対するその規制の影響を研究することができます。この技術の主な利点は、mRNAおよび翻訳開始の広いスペクトルにおける5'UTRおよび3'UTRのようなCis要素による翻訳調節の研究を可能にすることです。インビトロ転写されたRNAベースのルシファーゼレポーターアッセイは、キャップおよびその他の修飾に修飾を組み込み、翻訳に対する効果をテストするために使用するように調整され得る。まず、前方および逆プライマーを設計して、5〜3'方向に次の要素を含むPCRアンプリコンを生成する:T7-プロモーター、ポリ(A)リットル、T7_12A-Flucと呼ばれるポリ(A)尾部のホタルルシファーゼORFは、前方プライマーにいくつかの余分なヌクレオチドを含み、その後にT7プロモーターポリ(A)リットルまたは所望ましい5'UTR配列および約20ヌクレオチドを含むレポーター遺伝子のORFの5'末端に対応する溶融温度に基づいてプライマー長を調整し、プライマー内の対応する領域が遺伝子のセンス鎖と同一であることを確認します。次に、ポリ(A)尾と約20ヌクレオチドを含むようにリバースプライマーを設計します。レポーター遺伝子のORFの3'末端に対応する溶融温度に基づいて調整し、プライマーの対応する領域が遺伝子のアンチセンス鎖と同じであり、フレーム内停止コドンがPoly(A)尾の前に存在することを確認します。内部制御の場合は、5'~3'方向に次の要素を含むプライマーの別のセットを設計します:T7-プロモーター、コザック配列、レニラルシファーゼORF、およびポリ(A)テールを含むランダムな5'UTRコードシーケンスは、T7_Kozak-ルクと呼ばれます。反応をセットアップするには、PCRチューブに次の順序で試薬を加えます:DNaseフリーウォーター、2X高忠実度DNAポリメラーゼ、プライマーおよび配列確認されたルシファーゼテンプレートDNA。標準的な3段階PCRサイクルでDNAテンプレートを生成した後、分子量標準と共に1%アガロースTAEゲル電気泳動でPCR反応の5〜10%を実行してPCR産物を検出します。PCR産物のサイズを決定するには、UVイルミエータの下でゲルを視覚化します。PCR産物の正しいサイズを決定した後、100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を使用して市販のPCR精製キットを使用して、DNAを溶出させます。分光光度計を用いて精製したDNAの濃度を確認し、すぐにインビトロ転写に使用するためにマイナス20°Cで保存します。PCR産物からRNAを合成するには、マイクロ遠心分離管に次の試薬を加えます:DNase-RNaseフリーウォーター、NTPバッファーミックス、キャップアナログ、PCR製品テンプレート、およびIn vitroトランスクリプションキットからT7-RNAポリメラーゼミックス。よく混ぜます。37°Cで2時間インキュベートし、RNA精製キットを使用して合成されたRNAの精製に進みます。精製されたRNAを確認するには、RNAを70度で5分間加熱し、二次構造を除去し、1.5アガロースTBEゲルで実行します。次に、UVイルミエーターの下でゲルを視覚化します。分光光度計を用いて精製したRNAの濃度を確認します。アリコートはそれをし、マイナス80度で保存します。24ウェルプレートにHeLa細胞を播種して翌日80~90%の合流を達成し、5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターで一晩インキュベートします。5の感染の多重度でヒラ細胞をワクシニアウイルスに感染させ、比較のために感染していないHeLa細胞を保つ。その後、10〜12時間5%の二酸化炭素で37度のプレートをインキュベートします。感染後の所望時間の後、ホタルルシファーゼmRNAを含む12A配列の480ナノグラムと1つのマイクロ遠心チューブにレニラルシファーゼmRNAを持つコザック配列の20ナノグラムを混合する。別のマイクロ遠心分離チューブに、カチオン性脂質トランスフェクション試薬1.1マイクロリットルを加える。両方のチューブに55マイクロリットルの減らされた血清培地を加え、室温で5分間混合してインキュベートします。次に、減らされた血清培地を含む55マイクロリットルのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を、チューブをmRNAに加える。ピペットと軽く、しかし十分に混ぜ、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、細胞から細胞培養培地を取り出し、1ウェルあたり400マイクロリットルの減らされた血清培地を加える。インキュベーションが完了したら、24ウェルプレートのウェルごとに100マイクロリットルの混合物を加えます。12A FlucとKozak Rluc mRNAとの共トランスフェクション後5時間、細胞から還元された血清培地を除去し、ルシファーゼアッセイキットから150マイクロリットル1Xの溶菌バッファーを2つのレポーターアッセイを行うことができる。室温で10分間インキュベートした後、ゴムと滅菌シリンジを使用して細胞を掻き取り、マイクロ遠心チューブに移します。ペレット細胞の破片に、摂氏4度で10分間12,000回gのリセートを遠心分離する。不透明な壁の96ウェルのウェルあたり30マイクロリットルの上澄み物を固体底とよく白いアッセイプレートに移す。ルシファーゼアッセイキットとマルチモードプレートリーダールミノ計を使用して、原稿に記載されているように、キネティクス機能を使用して二重発光を測定します。発光読み取りデータを望ましいファイル形式にエクスポートした後、Fluc値を内部コントロールRluc値で割ることにより、感染していないHeLA細胞およびVACV感染HeLA細胞の12A Fluc mRNAからの相対翻訳速度を決定する。このアッセイは、感染していない細胞およびVACV感染細胞に5'Poly(A)リットルを含むFluc mRNAの翻訳効率をテストするために使用された。感染していない細胞とVACV感染細胞の両方がFlucおよびRluc mRNAとの共感染に成功した。FlucをRlucで分割すると、細胞内のRNA安定性におけるトランスフェクション効率が正常化した。mRNAを含む5'ポリ(A)リットルは、未感染細胞と比較して、VACV感染時に翻訳上の利点を有する。これは、MRNAトランスフェクションの5時間後に未感染細胞とVACV感染細胞においてRNAレベルが類似していたため、差動トランスフェクション効率またはmRNA安定性によるものではなかった。プライマーを設計する際には、PCR反応効率だけでなく、増幅DNAを必要とするすべての下流プロセスにも影響を与える可能性がありますので、特別な注意を払ってください。この方法は、Cis要素による翻訳調節を迅速にテストするための重要なアッセイです。可能であれば、この方法は他の相補的な実験によって裏付けられるべきです。ワクシニアウイルスを使用している間は予防措置を講じ、臭化エチジウムやフェノールなどの化学物質への暴露を避けるべきです。

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

免疫・感染学

Seven Steps to Stellate Cells

細胞星状に7つのステップ

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...