Name: in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

O projeto foi financiado pelos institutos nacionais de saúde (AI128406 www.nih.gov) para ZY e em parte pelo centro de pesquisa de câncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu), na forma de estudante de pós-graduação Summer stipend para PD.

1. preparação do modelo de DNA por PCR para transcrição in vitro
<ol><li>Para preparar o modelo de DNA por PCR, iniciadores de design. Ao projetar primers considerar características cruciais como primer comprimento, temperatura de recozimento (Tm), GC conteúdo, 3 ' final com G ou C etc. Nota: Discutido em detalhe nesta literatura25,26,27.</li>
	<li>Projete primeiras demão ...

<ol>
	<li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+protein+synthesis.">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Dogma+of+Molecular+Biology.">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes:+Mechanisms+and+Biological+Targets.">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress.">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li><li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).</li><li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes.">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li><li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tinkering+with+Translation:+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells.">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).</li><li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+against+the+Tide:+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff.">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li><li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5&#8217;+noncoding+region.">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5&#8217; noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li><li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA.">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li><li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3&#8242;+or+the+5&#8242;+untranslated+region.">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3&#8242; or the 5&#8242; untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li><li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3&#8242;+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses.">3&#8242; Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li><li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+poly(A)+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES.">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li><li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response.">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li><li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capped+poly(A)+leaders+of+variable+lengths+at+the+5&#8217;+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs.">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5&#8217; ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li><li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5&#8217;+poly(A)+leader+on+its+early+transcript.">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5&#8217; poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li><li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5&#8242;+poly(A)+leader.">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5&#8242; poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li><li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+initiation+and+3&#8242;+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs.">Pervasive initiation and 3&#8242; end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li><li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5&#8217;-poly(A)+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation.">The 5&#8217;-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase.">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li><li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff.">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li><li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors.">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23 (2005).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing.">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+the+5&#8242;+and+3&#8242;+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts.">Genome-Wide Analysis of the 5&#8242; and 3&#8242; Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li><li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).</li><li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter.">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li><li>Thornton, J. 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Todas as etapas do quatro-núcleo são críticas ao sucesso do in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Uma atenção especial deve ser dada ao projeto da primeira demão, especial para a seqüência do promotor T7. T7 RNA polymerase começa a transcrição do sublinhado primeiro G (ggg-5 '-UTR-Aug-) em T7 promotor adicionado antes da seqüência de 5 '-UTR. Embora o local do começo da transcrição (TSS) Comece do primeiro G no 5 ' extremidade, diminuindo o número de G ' s menos de tr...

De acordo com o dogma central, a informação genética flui do DNA para o RNA e, finalmente, para a proteína1,2. Este fluxo de informação genética é altamente regulamentado em vários níveis,incluindo a tradução mRNA3,4. O desenvolvimento de ensaios de repórter para medir a regulação da expressão gênica facilitará a compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos nesse processo. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a tradução do mRNA usando um in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase em pilhas poxvirus-infected.
Os poxvirus compreendem muitos micróbios patogénicos humanos e animais altamente perigosos5. Como todos os outros vírus, os poxvirus dependem exclusivamente de máquinas de células hospedeiras para síntese protéica6,7,8. Para sintetizar de forma eficiente as proteínas virais, os vírus evoluíram com muitas estratégias para a seqüestro da maquinaria translacional celular para redirecioná-la para a tradução de mRNAs virais7,8. Um mecanismo comumente empregado por vírus é o uso de elementos de ação cisem suas transcrições. Exemplos notáveis incluem o local de entrada Ribossome interna (ires) e o potenciador de tradução independente de Cap (CITE)9,10,11. Esses cis-elementos tornam as transcrições virais uma vantagem translacional atraindo máquinas translacionais através de diversos mecanismos12,13,14. Mais de 100 mRNAs de Poxvirus têm um elemento cis-acting evolutivamente conservado na região 5 '-Untranslated (5 '-UTR): um 5 '-Poly (a) líder no muito 5 ' extremidades destes mRNAs15,16. Os comprimentos destes 5 '-Poly (a) os líderes são heterogêneos e são gerados pelo derrapagem da polimerase poxvirus-codificada do RNA durante a transcrição17,18. Nós, e outro, descobrimos recentemente que o 5 '-Poly (a) o líder confere uma vantagem da tradução a um mRNA nas pilhas contaminadas com o vírus de vaccinia (vacv), o membro prototípicas de Poxvirus19,20.
O ensaio de repórter de luciferase baseado em RNA transcrito in vitro foi inicialmente desenvolvido para compreender o papel do líder 5 '-Poly (a) na tradução de mRNA durante a infecção pelo poxvirus19,20. Embora os ensaios do repórter do luciferase DNA-baseado do plasmídeo sejam amplamente utilizados, há diversos inconvenientes que complicarão a interpretação do resultado em pilhas poxvirus-contaminadas. Em primeiro lugar, os plasmís são capazes de replicar em células infectadas VACV22. Em segundo lugar, a transcrição críptica geralmente ocorre a partir do plasmídeo DNA18,23,24. Em terceiro lugar, a transcrição impulsionada pelo promotor VACV gera poli (A)-líder de comprimentos heterogêneos, consequentemente, dificultando o controle do comprimento do líder Poly (A) em alguns experimentos18. Um ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseado em RNA contorna estas edições e a interpretação dos dados é direta.
Há quatro etapas chaves neste método: (1) reacção em cadeia do polymerase (PCR) para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA; (3) transfection para entregar o mRNA nas pilhas; e (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução (Figura 1). O amplicon resultante do PCR contem os seguintes elementos no sentido 5 ' a 3 ': T7-promotor, líder poli (A) ou 5 '-seqüência desejada de UTR, frame de leitura aberto do luciferase do Firefly (ORF) seguido por uma cauda poli (A). O amplicon do PCR é usado como o molde para sintetizar mRNA pela transcrição in vitro usando o polymerase de T7. Durante a transcrição in vitro, o tampão de m7G ou o outro Analog do tampão são incorporados no mRNA recentemente sintetizado. As transcrições tampadas são transfected em células não infectadas ou VACV-infectadas. O lisado da pilha é coletado no tempo desejado após o transfection para medir atividades do luciferase que indicam a produção da proteína do mRNA transfected. Este ensaio do repórter pode ser usado para estudar a regulação da tradução pelo cis-elemento atual em 5 '-UTR, em 3 '-UTR ou em outras regiões de um mRNA. Além disso, o ensaio in vitro transcrito RNA-baseado pode ser usado para estudar os mecanismos diferentes da iniciação da tradução que incluem a iniciação tampão-dependente, a iniciação tampão-independente, a reiniciação e a iniciação interna como IRES.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492</td>
			<td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td>Anti reverse Cap analog or ARCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3693</td>
			<td>Opaque walled 96 well white plate with solid bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td>
			<td>OMEGA BIO-TEK</td>
			<td>D6492</td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM2010</td>
			<td>Referred as multimode plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td>In-Vitro transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Used to measure DNA and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080</td>
			<td>Capping system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells

Cada mRNA do poxvirus transcrito após a replicação viral do ADN tem um 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, não-modelado do 5 '-UTR. Para dissecar o papel de 5 '-Poly (A) líder na tradução de mRNA durante a infecção do poxvirus nós desenvolvemos in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Este ensaio do repórter compreende de quatro etapas do núcleo: (1) PCR para amplificar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA usando T7 RNA polimerase; (3) transfecção para introduzir in vitro o mRNA transcrito nas pilhas; (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução. O ensaio do repórter do luciferase RNA-baseado descrito aqui contorna edições da replicação do plasmídeo em pilhas poxvirus-contaminadas e na transcrição enigmático do plasmídeo. Este protocolo pode ser usado para determinar o Regulamento da tradução por cis-elementos em um mRNA que inclui 5 '-UTR e 3 '-UTR nos sistemas diferentes das pilhas poxvirus-contaminadas. Além disso, diferentes modos de iniciação de tradução, como o tampão-dependente, Cap-Independent, re-iniciação, e iniciação interna podem ser investigados usando este método.

As quatro etapas do ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseada em RNA: PCR para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro, in vitro a transcrição para gerar o mRNA, o transfection do mRNA, e a medida do luciferase, podem ser considerados no diagrama esquemático ( Figura 1). A concepção de primers para ambos os modelos de DNA (Fluc e rluc) e o esquema geral de extensão de saliência PCR é ilustrado no esquema (<strong class="...

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In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Nós apresentamos um protocolo para estudar o Regulamento da tradução de mRNA em pilhas poxvirus-contaminadas usando in vitro o ensaio do repórter da luciferase do RNA-baseado transcrito. O ensaio pode ser usado para estudar a regulação da tradução por cis-elementos de um mRNA, incluindo 5 '-região não traduzida (UTR) e 3 '-UTR. Diferentes modos de iniciação de tradução também podem ser examinados usando este método.

Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Nosso protocolo para um ensaio de luciferase in vitro transcrito baseado em RNA ajuda a estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo vírus da varíola. Além disso, um comprimento personalizado do poly(A)litro permite estudar seus efeitos regulatórios na tradução. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo da regulação da tradução por elementos cis como 5'UTR e 3'UTR em mRNA e amplo espectro de iniciação de tradução.O ensaio de repórter luciferase in vitro transcrito baseado em RNA pode ser adaptado para incorporar modificações na tampa e outras modificações e usado para testar o efeito na tradução. Para começar, projete primers para frente e para trás para gerar amplicon PCR contendo os seguintes elementos em 5'to 3'direction:T7-Promoter, Poly(A)litro, Firefly Luciferase ORF em uma cauda Poly(A)referida como T7_12A-Fluc, incluem vários nucleotídeos extras no primer dianteiro seguidos de T7-Promoter Poly(A)liter ou sequência desejada de 5'UTR e aproximadamente 20 nucleotídeos correspondentes ao final do ORF do gene repórter. Ajuste o comprimento do primer com base na temperatura de fusão correspondente ao orf do gene repórter, garantindo que a região correspondente no primer seja idêntica à cadeia de sentido do gene.Em seguida, projete o primer reverso para incluir a cauda Poly(A) e aproximadamente 20 nucleotídeos. Ajuste com base na temperatura de fusão correspondente ao ORF de 3'end do gene repórter garantindo que a região correspondente do primer seja idêntica à cadeia antissamante do gene e um códon de parada no quadro esteja presente antes da cauda Poly(A)." Para controle interno, projete outro conjunto de primers contendo os seguintes elementos em 5'to 3'direction:T7-Promoter, uma sequência aleatória de codificação utr de 5'UTR contendo sequência Kozak, Renilla Luciferase ORF e cauda Poly(A),referida como T7_Kozak-Rluc.Para configurar a reação, adicione reagentes na seguinte ordem a um tubo PCR:DNase água livre, polimerase de DNA de alta fidelidade 2X, primers e sequência confirmada DNA modelo de luciferase. Após um ciclo PCR padrão de três etapas para gerar um modelo de DNA, detecte o produto PCR executando 5-10% da reação do PCR em uma eletroforese de gel TAE de 1% agarose, juntamente com um padrão de peso molecular. Para determinar o tamanho do produto PCR, visualize o gel sob um iluminador UV.Depois de determinar o tamanho correto do produto PCR, purifique-o usando um kit de purificação PCR comercialmente disponível usando 100 microliters de água livre nuclease para elutar o DNA. Verifique a concentração do DNA purificado usando um espectotômetro e armazene-o a menos 20 graus Celsius para uso para transcrição in vitro imediatamente. Para sintetizar o RNA do produto PCR, adicione os seguintes reagentes a um tubo de microcentrifuuge: água livre DNase-RNase, mistura de tampão NTP, analógico da tampa, modelo de produto PCR e mistura de polimerase T7-RNA do kit de transcrição in vitro.Homogeneizar. Incubar a 37 graus Celsius por duas horas e, em seguida, proceder para a purificação do RNA sintetizado usando um kit de purificação de RNA. Para verificar o RNA purificado, aqueça o RNA a 70 graus durante cinco minutos para remover a estrutura secundária e executá-la em gel TBE de 1,5 agarose.Em seguida, visualize o gel sob um iluminador UV. Verifique a concentração do RNA purificado usando um espectotômetro. Aliquot-lo e armazenar a menos 80 graus Celsius.Sementes HeLa células em uma placa de 24 poços para alcançar 80-90% de confluência no dia seguinte e incubar durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Infectar células HeLa com vírus Vaccinia em uma multiplicidade de infecção de cinco e manter células HeLa não infectadas para comparação. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 a 12 horas.Após horas desejadas após a infecção, misture 480 nanogramas de sequência 12A com mRNA Firefly Luciferase e 20 nanogramas de sequência kozak com renilla Luciferase mRNA em um tubo de microcentrifuuge. Em outro tubo de microcentrifuge, adicione 1,1 microliters de reagente de transfecção lipídica cationic. Adicione 55 microliters de mídia súmumlica reduzida aos dois tubos, misture e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, adicione 55 microliters reagente de transfecção lipídica cationic contendo mídia de soro reduzido ao tubo contendo mRNA. Misture suavemente, mas bem com uma pipeta e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Durante a incubação, remova o meio de cultura celular das células e adicione 400 microliters de meio soro reduzido por poço.Quando a incubação estiver concluída, adicione 100 microliters da mistura, queda sábia e uniformemente por poço da placa de 24 poços. Cinco horas após a co-transfecção com 12A Fluc e Kozak Rluc mRNA, remova o meio sérico reduzido das células e lise as células adicionando 150 microliters 1X lysis tampão do kit de ensaio luciferase capaz de realizar dois ensaios repórteres. Depois de incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, raspe as células usando borracha e seringa estéril e transfira para um tubo de microcentrifuge.Para detritos de células de pelota, centrifugar o lysate a 12.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira 30 microliters de supernascer por poço de uma placa de ensaio 96 bem branca murada com um fundo sólido. Use o kit de ensaio luciferase e um luminômetro leitor de placas multi-modo para medir a luminescência dupla usando a função cinética como descrito no manuscrito.Depois de exportar os dados de leitura de luminescência em um formato de arquivo desejável, determine a taxa de tradução relativa de 12A Fluc mRNA em células HeLA não infectadas e VACV infectadas dividindo o valor Fluc por controle interno valor Rluc. Este ensaio foi usado para testar a eficiência de tradução de um mRNA Fluc que contém um 5'Poly(A)litro em células infectadas não infectadas e VACV. Ambas as células infectadas não infectadas e vacv foram co-transinfetadas com fluc e rluc mRNA.A divisão do Fluc por Rluc normalizou a eficiência de transfecção na estabilidade do RNA nas células. 5'Poly(A)litro contendo mRNA tem uma vantagem translacional durante a infecção pelo VACV em comparação com células não infectadas. Isso não foi devido à eficiência diferenciada de transfecção ou estabilidade do mRNA, uma vez que o nível de RNA foi semelhante em células infectadas pelo VACV cinco horas após a transfecção do mRNA.Tome cuidado especial ao projetar primers, pois isso pode afetar não apenas a eficiência de reação do PCR, mas também todos os processos a jusante que requerem o DNA amplificado. Este método é um importante ensaio para testar rapidamente o regulamento de tradução por elementos Cis. Se possível, esse método deve ser corroborado por outros experimentos complementares.Deve-se tomar precauções ao usar o vírus vaccinia e evitar a exposição a produtos químicos como brometo de ethidium e fenol.

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Translation: RNA to Protein

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