Name: in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells at JoVE.com

El proyecto fue financiado por los institutos nacionales de la salud (AI128406 www.nih.gov) a la ZY y en parte por el centro de investigación del cáncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu) en forma de postgrado estudiante verano Stipend a PD.

1. preparación de la plantilla de ADN por PCR para la transcripción in vitro
<ol><li>Para preparar la plantilla de ADN mediante PCR, diseñe imprimadores. Al diseñar imprimaciones considerar características cruciales como la longitud de imprimación, temperatura de recocido (Tm), contenido GC, 3 ' end con G o C, etc. Nota: Discutidos detalladamente en esta literatura25,26,27....

<ol>
	<li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+protein+synthesis.">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Dogma+of+Molecular+Biology.">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes:+Mechanisms+and+Biological+Targets.">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. 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S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors.">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23 (2005).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing.">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li><li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+the+5&#8242;+and+3&#8242;+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts.">Genome-Wide Analysis of the 5&#8242; and 3&#8242; Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. 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Todos los pasos de cuatro núcleos son fundamentales para el éxito del ensayo de reportero de luciferasa, basado en ARN transcrito in vitro. Se debe prestar especial atención al diseño de imprimación, especialmente para la secuencia de promotor T7. La polimerasa de T7 RNA comienza la transcripción de la primera G (gGG-5'-UTR-Aug-) subrayada en T7 promotor añadida antes de la secuencia 5 '-UTR. Aunque el sitio de inicio de la transcripción (TSS) comienza a partir de la primera G en el extremo 5 ', la disminu...

Según el dogma central, la información genética fluye del ADN al ARN y finalmente a la proteína1,2. Este flujo de información genética está altamente regulado en muchos niveles, incluyendo la traducción de mRNA3,4. El desarrollo de ensayos de reportera para medir la regulación de la expresión génica facilitará la comprensión de los mecanismos regulatorios involucrados en este proceso. Aquí describimos un protocolo para estudiar la traducción de mRNA usando un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa en células infectadas con poxvirus.
Los poxvirus comprenden muchos patógenos humanos y animales altamente peligrosos5. Como todos los demás virus, los poxvirus dependen exclusivamente de la maquinaria de célula huésped para la síntesis de proteínas6,7,8. Para sintetizar eficientemente las proteínas virales, los virus desarrollaron muchas estrategias para secuestrar la maquinaria celular translacional para redirigirla para la traducción de mRNAs virales7,8. Un mecanismo comúnmente empleado por virus es utilizar elementos de acción CISen sus transcripciones. Algunos ejemplos notables son el sitio de entrada ribosome interno (IRES) y el potenciador de la traducción independiente de la PAC (CITE)9,10,11. Estos elementos CIShacen de las transcripciones virales una ventaja traslacional al atraer maquinaria traslacional a través de diversos mecanismos12,13,14. Más de 100 mRNAs de poxvirus tienen un elemento de acción CISevolutivamente conservado en la región 5 '-no traducida (5 '-UTR): un 5 '-poli (a) líder en los 5 ' extremos de estos mRNAs15,16. Las longitudes de estos 5 '-Poly (A) líderes son heterogéneos y se generan por el deslizamiento de la polimerasa del arn codificado con poxvirus durante la transcripción17,18. Nosotros, y otros, recientemente descubrimos que el 5 '-poli (A) líder confiere una ventaja de traducción a un mRNA en las células infectadas con el virus vaccinia (VACV), el miembro prototypic de poxvirus19,20.
El ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa se desarrolló inicialmente para entender el papel del líder 5 '-Poly (A) en la traducción de mRNA durante la infección por poxvirus19,21. Aunque los ensayos de reportero de luciferasa basados en ADN plásmido han sido ampliamente utilizados, hay varios inconvenientes que complicarán la interpretación de resultados en las células infectadas por el poxvirus. En primer lugar, los plásmidos son capaces de replicar en las células infectadas por VACV22. En segundo lugar, la transcripción críptica a menudo ocurre a partir del ADN plásmido18,23,24. En tercer lugar, la transcripción impulsada por el promotor de VACV genera Poly (A)-líder de longitudes heterogéneas por lo que dificulta el control de la longitud del líder Poly (a) en algunos experimentos18. Un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa que evita estos problemas y la interpretación de los datos es sencilla.
Hay cuatro pasos clave en este método: (1) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar mRNA; (3) transfección para entregar mRNA en las células; y (4) la detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción (figura 1). El amplificador de PCR resultante contiene los siguientes elementos en la dirección 5 ' a 3 ': T7-Promoter, líder Poly (A) o la secuencia deseada de 5 '-UTR, luciferasa Firefly con marco de lectura abierta (ORF) seguida de una cola Poly (A). El amplicón de PCR se utiliza como la plantilla para sintetizar mRNA por transcripción in vitro usando la T7 polimerasa. Durante la transcripción in vitro, m7G Cap u otro análogo de la tapa se incorpora en el mRNA recién sintetizado. Las transcripciones coronadas se transfectadas en células no infectadas o infectadas por VACV. El lisado celular se recoge en el momento deseado después de la transfección para medir las actividades de luciferasa que indican la producción de proteínas del mRNA transfeccionado. Este ensayo reportero se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Element presente en 5 '-UTR, 3 '-UTR u otras regiones de un mRNA. Además, el ensayo in vitro transcrito basado en ARN puede utilizarse para estudiar diferentes mecanismos de iniciación de la traducción, incluyendo iniciación dependiente de la PAC, iniciación independiente de la tapa, reiniciación e iniciación interna como IRES.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2X-Q5 Master mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492</td>
			<td>High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#180;-O-Me-m7G(5&#39;)ppp(5&#39;)G RNA Cap Structure Analog</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td>Anti reverse Cap analog or ARCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3693</td>
			<td>Opaque walled 96 well white plate with solid bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1960</td>
			<td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td>
			<td>OMEGA BIO-TEK</td>
			<td>D6492</td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM2010</td>
			<td>Referred as multimode plate reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td>In-Vitro transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Used to measure DNA and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12183018A</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping System</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080</td>
			<td>Capping system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcribed rna-based luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infected cells

Cada poxvirus mRNA transcrito después de la replicación del ADN viral tiene un líder de 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, no con plantilla en el 5 '-UTR. Para diseccionar el papel de 5 '-Poly (A) líder en la traducción de mRNA durante la infección por el poxvirus desarrollamos un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa. Este ensayo de reportero consta de cuatro pasos principales: (1) PCR para amplificar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar ARNm utilizando la polimerasa de T7 RNA; (3) transfección para introducir in vitro el mRNA transcrito en las células; (4) detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción. El ensayo de la reportera luciferasa basado en ARN descrito aquí elude los problemas de la replicación plásmia en las células infectadas por el poxvirus y la transcripción críptica del plásmido. Este protocolo se puede utilizar para determinar la regulación de la traducción por CIS-Elements en un mRNA que incluye 5 '-UTR y 3 '-UTR en sistemas que no sean células infectadas por el poxvirus. Por otra parte, diferentes modos de iniciación de la traducción como dependiente de la PAC, Cap-independiente, re-iniciación, y la iniciación interna se pueden investigar utilizando este método.

Los cuatro pasos del ensayo in vitro transcrito de la luciferasa basada en ARN: la PCR para generar una plantilla de ADN para la transcripción in vitro, la transcripción in vitro para generar ARNm, la transfección de mRNA y la medición de luciferasa, se pueden ver en el diagrama esquemático ( Figura 1). El diseño de imprimadores para ambas plantillas de ADN (FLUC y Rluc) y el esquema general de PCR de extensión de voladizo se ilustra en el esquema (<st...

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In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Presentamos un protocolo para estudiar la regulación de la traducción de mRNA en células infectadas por poxvirus usando el ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN. El ensayo se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Elements de un mRNA, incluyendo 5 '-región no traducida (UTR) y 3 '-UTR. También se pueden examinar diferentes modos de iniciación de la traducción utilizando este método.

Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Nuestro protocolo para un ensayo de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN ayuda a estudiar la regulación de la traducción en células infectadas por el virus de la viruela. Además, una longitud personalizada del Poly(A)liter permite estudiar sus efectos regulatorios en la traducción. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la regulación de la traducción por parte de elementos Cis como 5'UTR y 3'UTR en ARNm y amplio espectro de iniciación de traducción.El ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro puede adaptarse para incorporar modificaciones al límite máximo y otras modificaciones y utilizarse para probar el efecto en la traducción. Para empezar, diseñe imprimaciones hacia adelante y hacia atrás para generar el amplicon PCR que contiene los siguientes elementos en 5'a 3'dirección:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF en una cola Poly(A) conocida como T7_12A-Fluc, incluyen varios nucleótidos adicionales en imprimación delantera seguidos de T7-Promotor Poly(A)litro o secuencia deseada 5'UTR y aproximadamente 20 nucleótidos correspondientes al extremo 5 del ORF del gen reportero. Ajuste la longitud de la imprimación en función de la temperatura de fusión correspondiente al 5'final del ORF del gen reportero, asegurándose de que la región correspondiente en la imprimación es idéntica a la cadena de detección del gen.A continuación, diseñe la imprimación inversa para incluir Poli(A)cola y aproximadamente 20 nucleótidos. Ajuste en función de la temperatura de fusión correspondiente al ORF del 3'end del gen reportero, asegurándose de que la región correspondiente de la imprimación sea idéntica a la cadena antisrés del gen y que haya un codón de parada en el marco antes de la cola Poly(A). Para el control interno, diseñe otro conjunto de imprimadores que contenga los siguientes elementos en 5'a 3'direction:T7-Promoter, una secuencia de codificación aleatoria de 5'UTR que contenga la secuencia Kozak, Renilla Luciferase ORF y Poly(A)tail, conocida como T7_Kozak-Rluc.Para configurar la reacción, añada reactivos en el siguiente orden a un tubo de PCR: agua libre de DNase, 2X de ADN polimerasa de alta fidelidad, imprimaciones y secuencia confirmada de ADN de plantilla luciferasa. Después de un ciclo estándar de PCR de tres pasos para generar una plantilla de ADN, detecte el producto PCR ejecutando 5-10% de la reacción pcr en una electroforesis de gel DE TAE de 1% de agarosa junto con un estándar de peso molecular. Para determinar el tamaño del producto PCR, visualice el gel bajo un iluminador UV.Después de determinar el tamaño correcto del producto PCR, purízalo utilizando un kit de purificación de PCR disponible comercialmente utilizando 100 microlitros de agua libre de nucleasas para eluir el ADN. Compruebe la concentración del ADN purificado utilizando un espectrofotómetro y guárdelo en menos 20 grados Celsius para su uso para la transcripción in vitro inmediatamente. Para sintetizar el ARN del producto PCR, añada los siguientes reactivos a un tubo de microcentrífuga: agua libre DNase-RNase, mezcla de búfer NTP, análogo de tapa, plantilla de producto PCR y mezcla de polimerasa T7-ARN del kit de transcripción in vitro.Homogeneizar. Incubar a 37 grados centígrados durante dos horas y luego proceder a la purificación del ARN sintetizado utilizando un kit de purificación de ARN. Para comprobar el ARN purificado, caliente el ARN a 70 grados durante cinco minutos para extraer la estructura secundaria y ejecútelo con gel TBE de 1,5 agarosa.A continuación, visualice el gel bajo un iluminador UV. Compruebe la concentración del ARN purificado utilizando un espectrofotómetro. Aliquot y almacenar a menos 80 grados Celsius.Células HeLa de siembra en una placa de 24 pozos para lograr 80-90% de confluencia al día siguiente e incubar durante la noche en una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Infectar las células de HeLa con el virus de la Vacuna a una multiplicidad de infección de cinco y mantener las células HeLa no infectadas para la comparación. Luego incubar la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 10 a 12 horas.Después de las horas deseadas después de la infección, mezclar 480 nanogramos de secuencia 12A con Arndor de Firefly Luciferase y 20 nanogramos de secuencia Kozak con Arnm De Renilla Luciferase en un tubo de microcentrífuga. En otro tubo de microcentrífuga, añadir 1,1 microlitros de reactivo de transfección lipídica catiónica. Añadir 55 microlitros de medios séricos reducidos a ambos tubos, mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, añada 55 microlitros de reactivo de transfección lipídica catiónica que contenga medios séricos reducidos al tubo que contiene ARNm. Mezclar suavemente pero a fondo con una pipeta e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la incubación, retire el medio de cultivo celular de las células y agregue 400 microlitros de medio sérico reducido por pozo.Una vez finalizada la incubación, añadir 100 microlitros de la gota de la mezcla sabia y uniformemente por pozo de la placa de 24 pozos. Cinco horas después de la co-transfección con 12A Fluc y Kozak Rluc mRNA, eliminar el medio sérico reducido de las células y lalyse las células mediante la adición de 150 microlitros 1X tampón de lisis del kit de ensayo Luciferase capaz de realizar dos ensayos de reportero. Después de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, raspe las células con goma y jeringa estéril y transfiera a un tubo de microcentrífuga.Para los desechos de células de pellet, centrifugar el izado a 12.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 30 microlitros de sobrenadante por pozo de una placa de ensayo blanca de 96 pozos con paredes opacas con un fondo sólido. Utilice el kit de ensayo De Luciferase y un luminómetro lector de placas multimodo para medir la luminiscencia dual utilizando la función cinética como se describe en el manuscrito.Después de exportar los datos de lectura de luminiscencia a un formato de archivo deseable, determine la tasa de traducción relativa de 12A Fluc mRNA en células HeLA no infectadas e infectadas por VACV dividiendo el valor Fluc por el valor Rluc de control interno. Este ensayo se utilizó para probar la eficiencia de traducción de un ARNm Fluc que contiene un 5'Poly(A)liter en células infectadas y infectadas por VACV. Tanto las células infectadas no infectadas como las células infectadas por VACV se cotrans infectaron con éxito con Fluc y Rluc mRNA.La división de Fluc por Rluc normalizó la eficiencia de la transfección en la estabilidad del ARN en las células. 5'Poly(A)liter que contiene ARNm tiene una ventaja traslacional durante la infección por VACV en comparación con las células no infectadas. Esto no se debió a la eficiencia diferencial de la transfección o a la estabilidad del ARNm, ya que el nivel de ARN era similar en las células infectadas no infectadas e infectadas por VACV cinco horas después de la transfección de ARNm.Tenga especial cuidado al diseñar imprimaciones, ya que esto puede afectar no sólo a la eficiencia de la reacción PCR, sino también a todos los procesos posteriores que requieren el ADN amplificado. Este método es un ensayo importante para probar rápidamente la regulación de traducción por elementos Cis. Si es posible, este método debe ser corroborado por otros experimentos complementarios.Se deben tomar precauciones durante el uso del virus de Vaccinia y evitar la exposición a sustancias químicas como bromuro de etidio y fenol.

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