Name: using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van K12CA090628 (SSK), het National Comprehensive Cancer Network (SSK), het Mayo Clinic Center for geïndividualiseerde geneeskunde (SSK), de Predolin Foundation (SSK), de Mayo Clinic Office of translation to practice (SSK), en de Mayo Clinic Medical Scientist training programma Robert L. Howell arts-wetenschapper beurs (RMS).

Dit protocol volgt de richtlijnen van de instellings Raad voor institutionele toetsing (IRB) en het Comité voor institutionele bioveiligheid (IBC) van de Mayo Clinic.
1. CART19 celproductie
<ol><li>T-cel isolatie, stimulatie en ex-vivo cultuur<ol>
<li>Voer alle celkweek werkzaamheden uit in een celcultuurkap met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Oogst perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van de geïdentificeerde normale donorbloed kegels die tijdens aferese word...

<ol>
	<li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies.">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma.">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia.">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas.">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li><li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells.">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li><li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li><li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+genome+editing:+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy.">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li><li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR/Cas9.">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li><li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts.">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li><li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers.">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li></ol>

In dit rapport beschrijven we een methodologie om CRISPR/Cas9-technologie te gebruiken voor het opwekken van secundaire wijzigingen in CAR-T-cellen. Specifiek, dit wordt aangetoond met behulp van lentivirale transductie met een virale vector die gRNA gericht op het gen van belang en Cas9 voor het genereren van GM-CSFk/o CART19 cellen. We hadden eerder aangetoond dat GM-CSF neutralisatie CRS en NT in een xenotransplantaatmodellen is-model uitstraalt. 12 zoals eerder beschreven, maken GM-...

Chimeric antigeen receptor T (CAR-T) celtherapie vertoont een grote belofte in de behandeling van kanker. 1 , 2 twee Car-T-celtherapieën gericht op CD19 (CART19) werden onlangs goedgekeurd in het Verenigd verklaarde en in Europa voor het gebruik in B celmaligniteiten na het aantonen van opvallende resultaten in multicenter klinische proeven. 3 , 4 , 5 barrières voor meer wijdverbreid gebruik van auto-T-cellen zijn beperkte activiteit in vaste tumoren en geassocieerde toxiciteiten, waaronder cytokine release SYNDROOM (CRS) en neurotoxiciteit (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 om de therapeutische index van Car-t-celtherapie te verbeteren, worden genoom engineering tools zoals zink vinger nucleasen, Talens en crispr gebruikt om de auto-t-cellen verder te wijzigen in een poging om minder toxische of effectievere auto-t-cellen te genereren. 10 , 11
In dit artikel beschrijven we een methode voor het genereren van CRISPR/Cas9 bewerkte CAR-T-cellen. Het specifieke doel van deze methode is het genetisch wijzigen van de auto-T cellen tijdens de productie van CAR-T cel via CRISPR/Cas9 om minder toxische of effectievere auto-T cellen te genereren. De logica voor het ontwikkelen van deze methodologie is gebaseerd op lessen geleerd uit klinische ervaring met CAR-T-celtherapie, die wijst op een dringende behoefte aan nieuwe strategieën om het therapeutische venster van CAR-T-celtherapie te verhogen en de toepassing uit te breiden tot andere tumoren en wordt ondersteund door de recente vooruitgang in de synthetische biologie waardoor meerdere modificaties van auto-T cellen die zijn begonnen met het betreden van de kliniek. Terwijl verschillende genoom engineering tools worden ontwikkeld en toegepast in verschillende instellingen, zoals zink vinger nucleasen, Talens en crispr, beschrijft onze methodologie crispr/Cas9 modificatie van Car-T cellen. 10 , 11 crispr/Cas9 is een op RNA gebaseerd bacterieel afweermechanisme dat is ontworpen om vreemd DNA te elimineren. Crispr vertrouwt op enzym om een doel sequentie te klieven die wordt geïdentificeerd door middel van een RNA geleider (grna). Crispr editing van Car-T cellen biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere genoom engineering tools. Deze omvatten nauwkeurigheid van de gRNA-sequentie, eenvoud om een gRNA te ontwerpen die gericht is op het gen van belang, hoge genbewerkings efficiëntie en de mogelijkheid om meerdere genen te targeten, omdat meerdere Grna's tegelijkertijd kunnen worden gebruikt.
Specifiek in de hier beschreven methoden gebruikten we een lentivirus codering CRISPR Guide RNA en Cas9 om een gen te verstoren tijdens auto-transductie van T-cellen. Bij het selecteren van een geschikte techniek om auto-T-cellen te bewerken, stellen we voor dat de hier beschreven techniek een efficiënt mechanisme is voor het genereren van onderzoekskrige auto-T-cellen, maar omdat het lange termijn effect van permanente integratie van Cas9 in het genoom onbekend is, Stel deze methodologie voor om proof of concept Research-cellen te ontwikkelen, maar niet voor het produceren van goede productiepraktijken met grade CAR-T-cellen.
In het bijzonder beschrijven we hier de generatie van granulocyt macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF) Knockout CAR-T cellen gericht op Human CD19. Deze auto-T-cellen werden gegenereerd door transductie met linvirale deeltjes die een specifieke RNA-gids coderen, specifiek voor GM-CSF (gennaam CSF2) en Cas9. We ontdekten eerder dat GM-CSF neutralisatie CRS en NT in een xenotransplantaatmodellen is-model uitstraalt. 12 GM-CSFk/o Car-t cellen zorgen voor de REMMING van GM-CSF tijdens het productieproces, effectief vermindering van de productie van GM-CSF terwijl het verbeteren van auto-T cel anti-tumor activiteit en overleving in vivo in vergelijking met wild type Car-t cellen. 12 zo bieden we hier een methodologie voor het genereren van crispr/CAS9 bewerkte Car-T-cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1377px;" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">12-0037-42</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">17-0038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Choice Taq Blue Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C775Y51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">CytoFLEX System B4-R2-V2</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">C10343</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human T Cell Isolation Kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:217px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Mouse Anti-Human CD107a&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">555800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Fixation Medium (Medium A)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS001S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:557px;">GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 
			CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: 
			pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: 
			High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 &#956;g (Free 
			of charge)</td>
			<td style="width:217px;">GenScript</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">https://tide.nki.nl.</td>
			<td style="width:217px;">Desktop Genetics</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum; Male Donors; type AB; US</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:123px;">35-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">47-7319-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monensin Solution, 1000X</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:123px;">420701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">559770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">561892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human MIP-1&#946; PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td style="width:123px;">560687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:217px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NALM6, clone G5&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-3273</td>
			<td>acute lymphoblastic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">P119C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid</td>
			<td style="width:217px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Permeabilization Medium (Medium B)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">GAS002S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K182001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td style="width:123px;">562930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RoboSep-S</td>
			<td style="width:217px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:123px;">85450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:557px;">Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td style="width:217px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:123px;">7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:123px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells

Chimeric antigeen receptor T (CAR-T) celtherapie is een Cutting Edge en potentieel revolutionaire nieuwe behandelingsoptie voor kanker. Echter, er zijn aanzienlijke beperkingen aan haar wijdverbreide gebruik bij de behandeling van kanker. Deze beperkingen omvatten de ontwikkeling van unieke toxiciteiten zoals cytokine release Syndrome (CRS) en neurotoxiciteit (NT) en beperkte expansie, Effector functies, en anti-tumor activiteit in vaste tumoren. Een strategie ter verbetering van de werkzaamheid van CAR-t en/of controle toxiciteiten van CAR-T-cellen is om het genoom van de auto-T-cellen zelf te bewerken tijdens de productie van auto-T-cel. Hier beschrijven we het gebruik van CRISPR/Cas9-genbewerking in CAR-T-cellen via transductie met een lentivirale constructie die een RNA-geleiding bevat naar granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) en Cas9. Als voorbeeld beschrijven we CRISPR/Cas9 gemedieerde Knockout van GM-CSF. We hebben aangetoond dat deze GM-CSFk/o Car-t cellen effectief minder GM-CSF produceren met behoud van kritische T cel functie en resulteren in verbeterde anti-tumor activiteit in vivo in vergelijking met wild type auto-T cellen.

Figuur 1 toont reductie van GM-CSF in GM-CSFk/o CART19 cellen. Om na te gaan of het genoom van de T-cellen werd gewijzigd om GM-CSF te Knockout, werd getij sequencing gebruikt in de GM-CSFk/o CART19 cellen (Figuur 1a). AUTO-T-celoppervlak kleuring verifieert dat de T-cellen de auto-oppervlak receptor in vitro met succes uitdrukken door te geren op levende CD3 + cellen (Figuur 1b...

Watch this Scientific Journal Video about Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells at JoVE.com

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Hier presenteren we een protocol voor genetisch gemodificeerde CAR-T cellen via een CRISPR/Cas9 systeem.

CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Ons protocol beschrijft de genetische modificatie van DE CEL VAN CAR-T tijdens hun productie via de CRISPR-technologie om effectiever en minder giftig product te genereren. Een voordeel van deze techniek is dat car-t celproductie en genetische manipulatie beide kunnen voorkomen in één cel met een goede efficiëntie. Het aantonen van de procedure zal Worden Rosalie Sterner, een MD promovendus, Michelle Cox, een technoloog en een afgestudeerde student, en Reona Sakemura, een postdoctoraat collega, uit mijn laboratorium.Na het isoleren van T-cellen uit geoogste perifere bloed mononucleaire cellen, beginnen met het kweken van hen door eerst de voorbereiding van T-cel medium en vervolgens steriliseren door het te filteren door middel van een 0,45 micrometer steriele vacuüm filter en vervolgens met een 0,22 micrometer steriele vacuüm filter. Op de dag van T-cel stimulatie of dag nul, voorafgaand aan stimulatie, wassen CD3/CD28 kralen door het plaatsen van de vereiste hoeveelheid kralen in een steriele 1,5 milliliter microcentrifuge buis en resuspending in een milliliter van TCM. Plaats de buis gedurende één minuut in contact met een magneet.Dan aspirate de TCM en resuspend in een milliliter verse TCM om de kralen opnieuw te wassen en te herhalen voor een totaal van drie wasbeurten. En tenslotte, resuspend de kralen in een milliliter van TCM. Na het tellen van de T-cellen, breng de kralen naar de T-cellen met een verhouding van drie tot een kralen naar cellen.Verdun vervolgens de cellen tot een uiteindelijke concentratie van een miljoen cellen per milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius, 5% CO2 gedurende 24 uur. Na het verwerven van een CART19 constructie in een lentivirale vector, uitvoeren lentivirale productie door de eerste uitbroeding lentiviral plasmide, verpakking vector, envelop vector, precomplexing reagens, transfectie reagens, en transfectie medium bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voer lentivirale werkzaamheden uit met behulp van BSL2+-voorzorgsmaatregelen, waaronder celkweekkappen, persoonlijke beschermingsmiddelen en desinfectie van gebruikte materialen met bleekmiddel voordat ze worden verwijderd.Voeg na incubatie deze transfectiereagentia toe aan de 293 T-cellen die 70 tot 90% samenvloeiing hebben bereikt en de getransfecteerde cellen kweken bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Op 24 en 48 uur na de doorfectie, oogst, centrifuge, filter en concentraat virus-bevattende supernatant door ultracentrifugatie en bevriezen bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Op dag één, voorzichtig resuspend T-cellen die zijn gestimuleerd op een miljoen cellen per milliliter op dag nul om de rozetten van cellen te breken.Voeg volgens de juiste BSL2+-voorzorgsmaatregelen vers of bevroren geoogst virus toe aan de gesimuleerde T-cellen bij een veelheid aan infectie van 3,0. Blijf de getransduceerde T-cellen uitbroeden bij 37 graden Celsius, 5%CO2. Op dag drie en vijf tellen ze CAR-T-cellen en voeg verse voorverwarmde TCM toe aan de cultuur om een CAR-T-celconcentratie van een miljoen cellen per milliliter te behouden.Zes dagen na de simulatie, verwijder kralen uit de getransduceerde T-cellen door eerst oogsten en resuspending de cellen. Breng de cellen in 50 milliliter conische buizen en plaats de buizen in een magneet voor een minuut. Na het verzamelen van de CAR-T cel-bevattende supernatant en het weggooien van de kralen, plaats de cellen terug in de cultuur op een concentratie van een miljoen cellen per milliliter in een cultuurkolf.Gebruik een monster van cellen voor stroomcytometrie om de oppervlakteexpressie van de CARs te beoordelen. De rest uitbroeden om de expansie te hervatten en vervolgens de cellen te oogsten en cryo-te bewaren op dag acht, zoals beschreven in het manuscript. Om de granulocyte macrofaag kolonie stimulerende factor verstoren, gebruik maken van een gids RNA zoals beschreven in het manuscript.Incubeertransfectiereagentia bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg ze na incubatie toe aan de 293 T-cellen die 70 tot 90% samenvloeiing hebben bereikt en kweek de getransfecteerde cellen bij 37 graden Celsius, 5% CO2 om een lentivirus te produceren. Op 24 en 48 uur, oogst en concentraat virus-bevattende supernatant door ultracentrifugatie in 50 milliliter ultracentrifuge buizen en bevriezen bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik.Dan op dag een, voorzichtig resuspend de T-cellen te breken rozetten rozetten. In een BSL2+-goedgekeurd laboratorium, om CAR-T-cellen te genereren, voegt u CAR19 lentivirus en GMCSF-gericht CRISPR lentivirus toe aan de gesimuleerde T-cellen. Op dag drie en dag vijf voor met succes getransduceerde lentiCRISPR-bewerkte T-cellen met puromycine resistentie, behandelen cellen met puromycine dihydrochloride bij een concentratie van een microgram puromycine per milliliter.Tide sequencing werd gebruikt om een GM-CSF vermindering van GM-CSF knock-out CART19 cellen te bevestigen met een verstoring efficiëntie van ongeveer 71%Flow percelen van CAR-T cel oppervlak vlekken gated op live CD3-positieve cellen blijkt dat zowel wild-type CART19 en GM-CSF knock-out CART19 met succes en op een soortgelijke manier express de CAR oppervlak receptor in vitro. Aan de andere kant, intracellulaire kleuring van GM-CSF door flow cytometrie ook gated op live CD3-positieve cellen toont een verminderde expressie van GM-CSF in de knock-out cellen in vergelijking met wild-type CART19 cellen bevestigen functioneel succes van de knock-out. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de transductiestappen van deze procedure, aangezien zij het meest van cruciaal belang zijn voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde CAR-T-cellen.De beschreven methode kan mogelijk worden toegepast op een verscheidenheid aan genen om CAR-T-cellen te wijzigen via CRISPR/CAS9 om te helpen bij het genereren van een minder giftig en effectiever product. CRISPR/CAS9-technologie biedt de strategieën om het genoom van CAR-T-cellen rechtstreeks te richten op het ontwikkelen van oplossingen voor de huidige klinische tekortkomingen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Intracraniële canule-implantatie voor seriële locoregionale chimere antigeenreceptor (CAR) T-celinfusies bij muizen

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...

Kwantificering van de telomeerlengte met behulp van niet-radioactieve chemiluminescentiedetectie

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Auteur in de schijnwerpers: optimalisatie van de prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest  

Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...