Name: exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins at JoVE.com

ويشكر صاحب البلاغ المعاهد الوطنية للصحة على تمويلها السابق.

ملاحظة: يوفر الشكل 1 ملخصاً للخطوات الرئيسية في عملية التحديد التكراري والتضخيم (SELEX).
1. إنشاء قالب مكتبة عشوائية
<ol><li>توليف التمهيدي إلى الأمام 5 '- GTAATACCTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' والتمهيدي العكسي 5 '- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' عن طريق التوليف الكيميائي على المزج الحمض النوو?...

<ol>
	<li>Pribnow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+an+RNA+polymerase+binding+site+at+an+early+T7+promoter.">Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).</li><li>Breathnach, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+expression+of+eucaryotic+split+genes+coding+for+proteins.">Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).</li><li>Wickens, M., Stephenson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+conserved+AAUAAA+sequence:+four+AAUAAA+point+mutants+prevent+messenger+RNA+3'+end+formation.">Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation.</a> Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAcompete+methodology+and+application+to+determine+sequence+preferences+of+unconventional+RNA-binding+proteins.">RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins.</a> Methods. 118, 3-15 (2017).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+massively+parallel+SELEX+for+characterization+of+human+transcription+factor+binding+specificities.">Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities.</a> Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures.">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).</li><li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA.">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (1989).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+polypyrimidine+tract-binding+protein+is+necessary+for+spermatid+individualization.">Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).</li><li>Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+RNA+recognition+motif+3+of+U2+snRNA+auxiliary+factor+(U2AF(65))+is+essential+in+vivo+but+dispensable+for+activity+in+vitro.">The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro.</a> RNA. 10 (65), 240-253 (2004).</li><li>Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determinants+of+RNA-binding+specificity+of+the+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C+proteins.">The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins.</a> J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).</li><li>Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+Sex-lethal+antagonizes+the+splicing+factor+U2AF+to+regulate+alternative+splicing+of+transformer+pre-mRNA.">The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA.</a> Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).</li><li>Wilson, C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+fluorophore-specific+DNA+aptamer+with+weak+redox+activity.">Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.</a> Chemistry &amp; Biology. 5 (11), 609-617 (1998).</li><li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflections+of+a+Darwinian+Engineer.">Reflections of a Darwinian Engineer.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).</li><li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development.">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).</li><li>Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Bind-n-Seq:+quantitative+assessment+of+the+sequence+and+structural+binding+specificity+of+RNA+binding+proteins.">RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins.</a> Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).</li><li>Szeto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID-SELEX+for+RNA+aptamers.">RAPID-SELEX for RNA aptamers.</a> PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).</li><li>Rohloff, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Ligands+With+Protein-like+Side+Chains:+Modified+Aptamers+and+Their+Use+as+Diagnostic+and+Therapeutic+Agents.">Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).</li><li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+multiplexed+proteomic+technology+for+biomarker+discovery.">Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).</li><li>Zhuo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+SELEX+Technology+and+Aptamer+Applications+in+Biomedicine.">Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li><li>Blind, M., Blank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+Selection+Technology+and+Recent+Advances.+Molecular+Therapy.">Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy.</a> Nucleic Acids. 4, e223 (2015).</li><li>Jijakli, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+selection+world.">The in vitro selection world.</a> Methods. 106, 3-13 (2016).</li></ol>

البروتينات الملزمة بالأحماض النووية هي جهات تنظيمية هامة لتنمية الحيوانات والنباتات. أحد المتطلبات الرئيسية لإجراء SELEX هو تطوير الفحص الذي يمكن استخدامه لفصل كسور الحمض النووي الريبي المرتبطة بالبروتين وغير المنضمة. من حيث المبدأ، يمكن أن يكون هذا الفحص في المختبر فحص ملزمة مثل الفحص مل...

في بيولوجيا الخلايا، تنظيم الجينات يلعب دورا مركزيا. في خطوة واحدة أو خطوات متعددة على طول مسار التعبير الجيني، الجينات لديها القدرة على تنظيمها. وتشمل هذه الخطوات النسخ (بدء، استطالة، وإنهاء) فضلا عن الربط، polyadenylation أو 3 'تشكيل نهاية، تصدير الحمض النووي الريبي، وترجمة mRNA، والاضمحلال / توطين النصوص الأولية. في هذه الخطوات، البروتينات الملزمة بالحمض النووي تعدل تنظيم الجينات. تحديد المواقع الملزمة لهذه البروتينات هو جانب مهم من دراسة السيطرة على الجينات. وقد استخدمت تحليل الطفرات ومقارنة التسلسل الجيني لاكتشاف التسلسل التنظيمي أو مواقع ربط البروتين في الأحماض النووية، مثل المروجين، ومواقع لصق، وعناصر تعدد الإنكار، وإشارات الترجمة1، 2 , 3 , 4.
الربط قبل mRNA هو خطوة لا تتجزأ خلال التعبير الجيني والتنظيم. غالبية جينات الثدييات، بما في ذلك تلك الموجودة في البشر، لديها الإنترونات. جزء كبير من هذه النصوص هو بدلا من ذلك لصقها، مما أدى إلى عدة الحمض النووي الريبي والبروتين isoforms من نفس الجينات أو النص الأولي. هذه الإيزوفورمات لها أدوار محددة الخلية والتنموية في بيولوجيا الخلايا. موقع الربط 5'، ونقطة الفرع، وموقع الربط polypyrimidine-tract/3' هي إشارات الربط الحرجة التي تخضع للتنظيم. في تنظيم سلبيّة, خلاف ذلك قوّيّة لصق موقعة قمعت, بينما في نظام تعديل إيجابيّة ضعيفة لصق موقعة يكون تنشيطت. مزيج من هذه الأحداث تنتج مجموعة كبيرة من isoforms متميزة وظيفيا. تلعب البروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي أدوارًا رئيسية في أحداث الربط البديلة هذه.
ومن المعروف العديد من البروتينات التي لا يزال من المقرر تحديد مواقعها الملزمة أو أهداف الحمض النووي الريبي5و6. وكثيرا ً ما يكون ربط البروتينات التنظيمية بأهدافها أو تسلسلاتها البيولوجية في المراحل النهائية عملية معقدة. وبالنسبة لهذه البروتينات، فإن تحديد الحمض النووي الريبي المستهدف أو موقع الربط هو خطوة هامة في تحديد وظائفها البيولوجية. وبمجرد تحديد موقع ملزم، يمكن زيادة وصفه باستخدام التحليلات الجزيئية والكيميائية الحيوية القياسية.
وللنهج الموصوف هنا ميزتان. أولا، فإنه يمكن تحديد موقع ربط غير معروف سابقا لبروتين من الفائدة. ثانياً، هناك ميزة إضافية لهذا النهج هي أنه يسمح في الوقت نفسه بتحول التشبع، الذي لولا ذلك لكان كثيف العمالة للحصول على معلومات قابلة للمقارنة حول متطلبات التسلسل داخل موقع الربط. وبالتالي، فإنه يوفر أداة أسرع وأسهل وأقل تكلفة لتحديد مواقع ربط البروتين في RNA. في الأصل، تم استخدام هذا النهج (SELEX أو التطور المنهجي للأربطة من قبل إثراء EXponential) لوصف موقع ملزم للبكتيريا T4 DNA polymerase (الجينات 43 البروتين)، الذي يتداخل مع موقع ربط ريبوسوم في mRNA الخاصة به. يحتوي موقع الربط على تسلسل حلقة 8-قاعدة، يمثل 65,536 متغير معشاة للتحليل7. ثانياً، استُخدم هذا النهج أيضاً بشكل مستقل لإظهار أنه يمكن اختيار مواقع ربط محددة أو aptamers لأصباغ مختلفة من مجموعة من حوالي 1013 تسلسل8. في الواقع، وقد استخدم هذا النهج على نطاق واسع في العديد من السياقات المختلفة لتحديد aptamers (RNA أو تسلسل الحمض النووي) لربط العديد من ligands، مثل البروتينات والجزيئات الصغيرة، والخلايا، وللحفز9. على سبيل المثال، يمكن أن تميز aptamer بين اثنين من مشتقات الزانثين، الكافيين والثيوفيلين، والتي تختلف من خلال وجود مجموعة الميثيل واحدة في الكافيين10. لقد استخدمنا هذا النهج على نطاق واسع (SELEX أو التكراري اختيار التضخيم) لدراسة كيفية عمل البروتينات الملزمة RNA في الربط أو الربط اللائحة11، والتي ستكون الأساس للمناقشة أدناه.
المكتبة العشوائية: استخدمنا مكتبة عشوائية من 31 نيوكليوتيدات. واستند النظر في طول المكتبة العشوائية بشكل فضفاض على فكرة أن عامل الربط العام U2AF65 يرتبط بتسلسل بين تسلسل نقطة الفرع وموقع الربط 3. في المتوسط، والتباعد بين هذه الإشارات الربط في الميتازوانات هو في نطاق 20 إلى 40 النيوكليوتيدات. ومن المعروف بروتين آخر الجنس القاتلة لربط تسلسل التنظيمية سيئة تتميز بالقرب من موقع لصق 3 'من الهدف قبل mRNA، محول. وهكذا، اخترنا منطقة عشوائية من 31 النيوكليوتيدات، وتحيط بها مواقع الربط التمهيدي مع مواقع إنزيم تقييد للسماح لتضخيم PCR والتعلق من T7 RNA بوليميراز المروج للنسخ في المختبر. كان حجم المكتبة النظرية أو تعقيد431 أو ما يقرب من 1018. استخدمنا جزء صغير من هذه المكتبة لإعداد تجمع الحمضالنووي الريبي العشوائي لدينا (~ 10 12-1015)للتجارب الموضحة أدناه.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant PTB</td>
			<td>Laboratory Preparation</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0277S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins

يلعب تنظيم الجينات دورًا هامًا في جميع الخلايا. يتم استخدام خطوات النسخ، وما بعد النسخ (أو معالجة الحمض النووي الريبي)، والترجمة، وخطوات ما بعد الترجمة لتنظيم جينات محددة. تستهدف البروتينات الملزمة بالحمض النووي الخاصة بالتسلسل تسلسلات محددة للتحكم في التعبير الجيني المكاني أو الزمني. تتميز مواقع الربط في الأحماض النووية عادة بتحليل الطفرة. ومع ذلك، فإن العديد من البروتينات ذات الأهمية ليس لها موقع ملزم معروف لمثل هذا الوصف. هنا نقوم بوصف نهج لتحديد مواقع الربط غير معروف سابقا للبروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي. وهو ينطوي على اختيار تكراري وتضخيم تسلسل بدءا من تجمع تسلسل معشاة. بعد عدة جولات من هذه الخطوات النسخ، ملزمة، وتضخيم-تسلسل المخصب يتم تسلسل لتحديد موقع (مواقع) ملزمة المفضلة. يتم رصد نجاح هذا النهج باستخدام الاختبارات الملزمة في المختبر. وفي وقت لاحق، يمكن استخدام الاختبارات الوظيفية في المختبر وفي الجسم الحي لتقييم الأهمية البيولوجية للتسلسلات المختارة. ويسمح هذا النهج بتحديد وتوصيف موقع (مواقع) ملزمة لم تكن معروفة من قبل لأي بروتين ملزم بالحمض النووي الريبي الذي يوجد له أي وصف لفصل RNAs المرتبط بالبروتين وغير المنضم.

وتبين الملاحظات التالية نجاح عملية التضخيم والتحديد (SELEX). أولاً، قمنا بتحليل التجمع 0 والتسلسلات المحددة لربط البروتين المستخدم لنهج التضخيم التكراري. ويبين الشكل 2 أن البروتين الملزم للبوليبيريميدين الثدييات (PTB) يظهر بالكاد الربط القابل للكشف لتسلسل ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins at JoVE.com

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

استكشاف مساحة التسلسل لتحديد مواقع الربط للبروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي التنظيمية

خصوصية التسلسل أمر بالغ الأهمية لتنظيم الجينات. البروتينات التنظيمية التي تعترف تسلسل معين مهمة لتنظيم الجينات. إن تحديد مواقع الربط الوظيفي لهذه البروتينات يمثل مشكلة بيولوجية صعبة. ويرد هنا وصف لنهج تكراري لتحديد موقع ملزم لبروتين ملزم بالحمض النووي الريبي، وهو ينطبق على جميع البروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي.

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

ويستخدم البروتوكول لتشبع الطفرات من موقع البروتين ملزمة. إذا لم يكن موقع الربط البروتيني الخاص بك معروفًا، يمكن تحديده باستخدام هذا البروتوكول. هذه التقنية لها صلة لتشخيص المرض والعلاج.وأعتقد أن إمكاناتها الكاملة في العلوم الطبية الحيوية لا تزال يتعين استغلالها بالكامل. يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع على أي بروتين أو رد فعل حيث يمكن فصل الجزيئات المطلوبة من الجزيئات غير المرغوب فيها. تأكد من أن المكتبة هي عشوائية بشكل صحيح، وتأكد من أنه خلال كل خطوة ربط وفصل أضعاف إثراء الجزيئات المطلوبة عالية.وهو ينطوي على عدة خطوات وتفاصيل كثيرة يتم توضيحها بشكل أفضل ، بدلاً من شرحها بالكلمات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون مرتاحًا لكيفية إعداد مكتبة عشوائية ، وتجميع تجمع RNA ، وإجراء تفاعل ملزم للجزيئات المنفصلة المرغوبة وغير المرغوب فيها للحصول على تقارب عالي وموثقات محددة. أولا، توليف التمهيدي إلى الأمام وا لأولية عكسها عن طريق التركيب الكيميائي على المزج الحمض النووي.أيضا، توليف قالب oligonucleotide مكتبة عشوائية مع 31 المواقف العشوائية. في أنبوب PCR، مزيج واحد micromolar الحمض النووي قالب مكتبة عشوائية، واحد micromolar إلى الأمام التمهيدي يحتوي على T7 RNA البوليميراز المروج واكتبي عكس، 20 ملليمولار تريس في رقم هيدروليكي ثمانية، 1.5 ملليمولار كلوريد المغنيسيوم، 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ميكروغرام لكل ملليلتر أسيتتيلات مصل الأسيتين الألبومين، وحدتين من البوليميراز طق، و 200 ميكرومولر كل من dNTPs. إعداد جهاز PCR مع خمس دورات من denaturation، والحن، وخطوات التمديد، تليها دورة واحدة من التمديد لإرفاق المروج إلى مكتبة الحمض النووي.إعداد رد فعل النسخ 100 ميكرولتر تحتوي على T7 النسخ العازلة، واحد micromolar بركة مكتبة عشوائية الحمض النووي، خمسة ملليمولار DTT، 2 ملليمتر GTP، ملليمتر واحد كل من ATP، CTP، وUTP، واثنين من وحدات لكل ميكرولتر T7 RNA البوليميراز. الآن وضعت على درع زجاجي الاكريليك والقفازات. إدخال النشاط الإشعاعي عن طريق إضافة 5 ميكرولترات أو أقل من ألفا-32P UTP في رد فعل النسخ للتصوير الذاتي.احتضان خليط التفاعل في أنبوب microcentrifuge لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. لجل تنقية الجيش الملكي النيبالي، وإعداد هلام بولياكريلاميد 10٪denaturing. تحميل العينات في آبار الجل.عرض الجل للفيلم بالأشعة السينية، وتحديد موقع النصوص على هلام وقطع شريحة هلام. ضع شريحة الجل في أنبوب الطرد المركزي واقطع إلى قطع أصغر مع طرف التجانس. إضافة البروتين K العازلة لتزج القطع هلام.اترك الأنبوب على المُطعم لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم تدور في الطرد المجهري عالية السرعة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحطام هلام واستعادة الحل العازلة. أضف كمية متساوية من الفينول-كلوروفورم إلى الأنبوب مع المُتَرَض، الدوامة، والطرد المركزي.كرر استخراج مع الفينول-كلوروفورم مرة أخرى ثم مع كلوروفورم مرة أخرى. بعد ذلك، اخلطي المرحلة مائي من البروتينات K العازلة مع 1/10 حجم من خلات الصوديوم ثلاثة المولار في درجة حرارة 5.2، 10 ميكروغرام من الرنا أو 20 ميكروغرام من الجليكوجين، واثنين إلى ثلاثة مجلدات من الايثانول المخزنة في ناقص 20 درجة مئوية. اترك الأنبوب عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لساعة واحدة.تدور أنبوب يحتوي على الحل لمدة خمس إلى 10 دقائق في أربع درجات مئوية في microcentrifuge. تجاهل supernatant بعناية، وإضافة 70٪ الإيثانول لشطف بيليه الجيش الملكي النيبالي. تدور لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.التعرق الإيثانول بعناية، والهواء الجافة بيليه الحمض النووي الريبي. المقبل، إضافة 50 ميكرولترات من المياه المعالجة مع DEPC ل solubilize بيليه الجيش الملكي النيبالي. اترك العينة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية للتخزين.لربط البروتين والRNA في حجم رد فعل من 100 ميكرولترات، أولا إعداد 10 ملليمولار تريس هيدروكلوريد في 7.5 pH تحتوي على 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم، واحد ملليمولار DTT، 09 ميكروغرام لكل ميكرولتر بولين مصل البقر، 5 وحدات لكل ميكرولتر RNAsin، 15 ميكروغرام لكل ميكرولتر TRNA، و1 ملليمورار EDTA. ثم إضافة 30 ميكرولترات من البروتين المؤتلف PTB و 10 ميكرولترات من RNA من التجمع المناسب. ضع الأنابيب التي تحتوي على التفاعلات الملزمة في كتلة درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.المقبل، تجزئة الجيش الملكي النيبالي من الجيش الملكي النيبالي غير المنضم من خلال أربع جولات من الاختيار والتضخيم. أولاً، قم بتصفية عينة 100 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة من خلال فلتر نيتروسيلولوزي متصل بفراغ متعدد. يبقى مجمع البروتين الـ RNA على الفلتر.مع شفرة حلاقة معقمة، قم بقطع الفلتر إلى شظايا، وأدخل هذه في أنبوب الطرد المركزي. غمر قطع التصفية في مخزن البروتينات K المؤقت، وضعه على بهلوان لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها لاسترداد الحمض النووي الريبي. لفك البروتين العينة RNA، إضافة حجم متساو من الفينول الكلوروفورم، دوامة، ثم الطرد المركزي بسرعة عالية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.الحصول على المرحلة مائي، واستخراج مع الكلوروفورم مرة أخرى. بعد ذلك، اخلطي الماجنة مع حجم 1/10 من خلات الصوديوم ثلاثية المولر عند الأسكH 5.2 واثنين إلى ثلاثة مجلدات من الإيثانول المطلق. اترك الأنبوب في ثلاجه مئوية ناقص 80 درجة لمدة 30 دقيقة، ثم طرد مركزي بسرعة عالية لمدة 10 دقائق.كرر خطوات الغسيل والتجفيف مع 70٪ من الإيثانول، و solubilize الجيش الملكي النيبالي في المياه المعالجة DEPC. بعد الجولة الأولى من تصفية ربط الفحص، تنفيذ ثلاث جولات أخرى. بعد ذلك، قم بتنفيذ جولتين من النسخ، والربط، والتضخيم لفصل كسور الحمض النووي الريبي المرتبطة بالبروتين عن الكسور غير المنضمة.Precast الأصلي 5 ٪ polyacrylamide هلام مع 60 إلى واحد الاكريلاميد - bis - الاكريلاميد نسبة في 5x TBE العازلة. ثم إعداد رد فعل ملزم RNA البروتين. وضع الجل في جهاز الكهرباء مملوءة العازلة TBE 5x في غرفة باردة في أربع درجات مئوية.تطبيق 250 فولت لمدة 15 دقيقة، والميصة رد فعل ملزم في آبار مختلفة. ثم تجزئة إضافية من RNA المنضمة من RNA غير منضم عن طريق تشغيل الكهرباء في 250 فولت لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد ذلك، قم بكشف الجل للفيلم بالأشعة السينية، وتحديد موقع الحمض النووي الريبي المقيد باستخدام التصوير الآلي.قطع شريحة هلام مع الجيش الملكي النيبالي منضم، وإدراجه في أنبوب. سحق شريحة هلام، واحتضان في المخزن المؤقت البروتينات K لمدة ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها. كرر الاستخراج بالفينول- الكلوروفورم والكلوروفورم كما سبق وصفه.توليف cDNA من الحمض النووي الريبي المذاب. إعداد 20 ميكرولترات من رد الفعل، بما في ذلك اثنين من microliters من 10x RT العازلة، واثنين من microliters من النسخ العكسي AMV، وميكر واحد من التمهيدي العكسي، وخمسة ميكرولترات من الماء، و 10 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المذاب. احتضان في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.تضخيم cDNA باستخدام 20 إلى 25 دورة PCR كما هو موضح سابقا. كرر عملية تخليق الحمض النووي الريبي، البروتين ملزمة، وفصل البروتين ملزمة وغير منضم الكسور. لتحليل ربط البروتين، استخدم تحليل تحول الهلام أو مقايسة الربط للتصفية لتحديد تقارب الربط وخصوصية تجمعات محددة أو تسلسلات فردية داخل كل تجمع.استخدام التصوير الآلي أو صورة الفوسفور للكشف عن وقياس النطاقات في الكسر المنضم والكسر غير المنضم. متابعة البروتوكول مع استنساخ ومحاذاة التسلسل. وفي هذه الدراسة، تم تحقيق نجاح في عملية التضخيم في الاختيار.يظهر البروتين الملزم للثدييات متعدد المسالك البوليبيريمين مع تركيز البروتين العالي 300 ضعف الربط بالكاد يمكن اكتشافه لتسلسل التجمع صفر ولكن تقاربًا عاليًا لتجمع التسلسل المحدد. اختيار التضخيم التي تم تحديدها بنجاح على البروتينات RNA ملزمة مع موقع الربط المفضل أو توافق الآراء. إضافة PTB المؤتلف، الذي يربط إلى موقع ربط ثلاثة رئيس المنبع، يؤدي إلى تنشيط موقع لصق ثلاثة رئيس بديل أو المصب.في المقابل، إضافة المؤتلف hnRNP C يؤدي إلى قمع كل من ثلاثة رئيس لصق المواقع. بالإضافة إلى عامل الربط العام المؤتلف U2AF65 عكس hnRNP C-بوساطة ثلاثة رئيس موقع لصق القمع. من المهم أن نتذكر أن مكتبة جيدة عشوائية وشروط ملزمة السليمة التي تعطي إثراء أضعاف عالية في كل خطوة ملزمة ضرورية للنجاح.يمكن استخدام الفحوصات الوظيفية المناسبة والاختبارات الحية للتحقق من صحة نتيجة هذا النهج. في مجال التعبير الجيني، تمت دراسة وظائف العديد من البروتينات باستخدام هذه التقنية. من المهم استخدام القفازات والختم المشع للحماية أثناء العمل مع البولي أكريلاميد والنشاط الإشعاعي.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

الببتيد المستمدة من طريقة لنقل الجينات والبروتينات عبر الخلوي والحواجز Organellar في النباتات

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

ساعد فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية لتدبير الكروماتين الوصول في خلايا الثدييات

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

نهجاً الطفرات تشبع رواية: وصف خطوة مفردة بروتين تنظيمي ملزم مواقع في الجيش الملكي النيبالي باستخدام فوسفوروثيواتيس

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...