Name: exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins at JoVE.com

המחבר מודה למוסדות הבריאות הלאומיים למימון העבר.

הערה: איור 1 מספק סיכום של שלבי מפתח בתהליך הגברה בחירה איטראטיבי (selex).
1. יצירת תבנית ספריה אקראית
<ol><li>לסנתז את פריימר קדימה 5 '- Gtaאטקגנולג ' טtgatcaGATTCTGATCCA-3 ' ואת פריימר הפוכה 5 '-GCGACGgatccaagcttca-3 ' על ידי סינתזה כימית על סינתיסייזר DNA. הערה: התחל והספרייה האקראי?...

<ol>
	<li>Pribnow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+an+RNA+polymerase+binding+site+at+an+early+T7+promoter.">Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).</li><li>Breathnach, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+expression+of+eucaryotic+split+genes+coding+for+proteins.">Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).</li><li>Wickens, M., Stephenson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+conserved+AAUAAA+sequence:+four+AAUAAA+point+mutants+prevent+messenger+RNA+3'+end+formation.">Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation.</a> Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAcompete+methodology+and+application+to+determine+sequence+preferences+of+unconventional+RNA-binding+proteins.">RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins.</a> Methods. 118, 3-15 (2017).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+massively+parallel+SELEX+for+characterization+of+human+transcription+factor+binding+specificities.">Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities.</a> Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures.">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).</li><li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA.">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (1989).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+polypyrimidine+tract-binding+protein+is+necessary+for+spermatid+individualization.">Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).</li><li>Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+RNA+recognition+motif+3+of+U2+snRNA+auxiliary+factor+(U2AF(65))+is+essential+in+vivo+but+dispensable+for+activity+in+vitro.">The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro.</a> RNA. 10 (65), 240-253 (2004).</li><li>Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determinants+of+RNA-binding+specificity+of+the+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C+proteins.">The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins.</a> J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).</li><li>Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+Sex-lethal+antagonizes+the+splicing+factor+U2AF+to+regulate+alternative+splicing+of+transformer+pre-mRNA.">The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA.</a> Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).</li><li>Wilson, C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+fluorophore-specific+DNA+aptamer+with+weak+redox+activity.">Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.</a> Chemistry &amp; Biology. 5 (11), 609-617 (1998).</li><li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflections+of+a+Darwinian+Engineer.">Reflections of a Darwinian Engineer.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).</li><li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development.">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).</li><li>Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Bind-n-Seq:+quantitative+assessment+of+the+sequence+and+structural+binding+specificity+of+RNA+binding+proteins.">RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins.</a> Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).</li><li>Szeto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID-SELEX+for+RNA+aptamers.">RAPID-SELEX for RNA aptamers.</a> PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).</li><li>Rohloff, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Ligands+With+Protein-like+Side+Chains:+Modified+Aptamers+and+Their+Use+as+Diagnostic+and+Therapeutic+Agents.">Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).</li><li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+multiplexed+proteomic+technology+for+biomarker+discovery.">Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).</li><li>Zhuo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+SELEX+Technology+and+Aptamer+Applications+in+Biomedicine.">Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li><li>Blind, M., Blank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+Selection+Technology+and+Recent+Advances.+Molecular+Therapy.">Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy.</a> Nucleic Acids. 4, e223 (2015).</li><li>Jijakli, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+selection+world.">The in vitro selection world.</a> Methods. 106, 3-13 (2016).</li></ol>

חומצות גרעין מחייב חלבונים הם הרגולטורים חשובים של בעלי חיים ופיתוח הצמח. דרישה מרכזית עבור הליך SELEX היא התפתחות של מעשה שניתן להשתמש בו כדי להפריד שברים RNA בעלי מאוגד חלבון ובלתי מאוגד. בעיקרון, היכולת הזאת יכולה להיות בתוך שיטת מחייב מחוץ לחוק, כגון השילוב של איגוד המסננים, שיטת התזוזה של ...

בביולוגיה של התאים, רגולציה. גנטית ממלאת תפקיד מרכזי באחד או מספר שלבים לאורך מסלול ביטוי הגן, גנים יש את הפוטנציאל להיות מוסדר. שלבים אלה כוללים תמלול (ייזום, התארכות וסיום), כמו גם שחבור, פוליאדלציה או 3 ' היווצרות בסוף, RNA ייצוא, התרגום mRNA, ו ריקבון/לוקליזציה של תעתיקים העיקרי. בשלבים אלה, חומצות גרעין מחייב חלבונים לווסת את רגולציה גנים. זיהוי של אתרי איגוד עבור חלבונים כאלה הוא היבט חשוב של לימוד בקרת גנים. ניתוח מועד והשוואת הרצף פילוגנטי שימשו כדי לגלות רצפי רגולציה או מחייב חלבונים אתרים בחומצות גרעין, כגון היזמים, אחוי אתרים, מרכיבים פוליאדלציה, ואותות טרנסלtional1, מיכל השני , מיכל שלוש , ד.
שחבור טרום-mRNA הוא צעד אינטגרלי במהלך ביטוי גנים ורגולציה. רוב הגנים המיונקים, כולל אלה בבני האדם, יש היפוגנים. חלק גדול של התעתיקים האלה הוא לחילופין משולב, הפקת מספר mrna ו איזופורמים חלבון מאותו גן או תעתיק ראשוני. איזוטפסים אלה הם בעלי תפקידים ספציפיים לתאים והתפתחותיים בביולוגיה של התא. האתר של 5 ' אחוי, נקודת ההסתעפות, והאתר הנמצא במערכת העיכול/3, מהווה אותות קריטיים הכפופים לרגולציה. בתקנה שלילית, האתר החזק ביותר במקום הוא מודחק, ואילו בתקנה חיובית האתר מופעל בצורה אחרת. שילוב של אירועים אלה מייצר שפע של איזוטפסים ברורים מבחינה פונקציונלית. כריכת ה-RNA חלבונים לשחק תפקידים מרכזיים אלה שחבור האירועים החלופיים.
חלבונים רבים ידועים כאשר האתרים המחייבים (s) או יעדי RNA נשארים להיות מזוהים5,6. קישור חלבונים רגולטוריות למטרות ביולוגיות שלהם במטה או רצפים הוא לעתים קרובות תהליך מורכב. עבור חלבונים כאלה, זיהוי של היעד שלהם RNA או מחייב אתר הוא צעד חשוב בהגדרת פונקציות ביולוגיות שלהם. לאחר מזוהה אתר מחייב, זה יכול להיות מאופיין עוד באמצעות ניתוחים מולקולריים סטנדרטיים ביוכימיים.
לגישה המתוארת כאן יש שני יתרונות. ראשית, הוא יכול לזהות אתר מחייב לא ידוע בעבר עבור חלבון של עניין. שנית, יתרון נוסף של גישה זו הוא שהוא מאפשר בו זמנית מוטזיס רוויה, שאחרת תהיה עבודה אינטנסיבית להשגת מידע דומה על דרישות הרצף בתוך אתר האיגוד. כך, הוא מציע כלי מהיר, קל יותר, פחות יקר לזהות אתרי כריכת חלבון ב-RNA. במקור, גישה זו (SELEX או האבולוציה שיטתית של ליגנדס על ידי העשרה מעריכית) שימש כדי לאפיין את האתר מחייב עבור בקטיוגה T4 DNA פולימראז (הגן 43 חלבון), אשר חופף עם האתר המחייב הריבוכמה ב-mRNA שלה. אתר הכריכה מכיל רצף לולאה של 8 בסיסים, המייצג 65,536 גרסאות אקראיים לניתוח7. שנית, הגישה השתמשה גם באופן עצמאי כדי להראות כי אתרים מסוימים מחייב או aptamers עבור צבעים שונים ניתן לבחור מתוך בריכה של כ 1013 רצפים8. למעשה, גישה זו היתה בשימוש נרחב בהקשרים שונים רבים כדי לזהות aptamers (RNA או רצפי DNA) עבור כריכת ליגנדס רבים, כגון חלבונים, מולקולות קטנות, תאים, ועבור מזרז9. כדוגמה, aptamer אלף יכול להפלות בין שתי הנגזרות האלה, קפאין ו-הפסלין, אשר שונים על ידי נוכחות של קבוצת מתיל אחד בקפאין10. השתמשנו בהרחבה בגישה זו (SELEX או הגברה בחירה איטראטיבית) כדי ללמוד כיצד להשתמש בחלבונים מבוססי RNA הפועלים באמצעות שחבור או בתקנה11, אשר יהיה הבסיס לדיון להלן.
הספרייה האקראית: השתמשנו בספריה אקראית של 31 נוקלאוטידים. השיקול האורך עבור הספרייה האקראית היה מבוסס באופן רופף על הרעיון כי הU2AF הכללית גורם השחבור65 נקשר לרצף בין רצף נקודת ההסתעפות לבין 3 ' אחוי האתר. בממוצע, המרווח בין האותות האלה במטזואים הוא בטווח של 20 עד 40 נוקלאוטידים. חלבון אחר סקס-קטלני היה ידוע לאגד רצף הרגולציה מאופיין גרוע ליד 3 ' אחוי האתר של היעד שלה pre-mRNA, שנאי. כך, בחרנו אזור אקראי של 31 נוקלאוטידים, מוקף באתרי כריכה פריימר עם אתרי אנזים הגבלה כדי לאפשר הגברה PCR והחזקה של היזם T7 RNA פולימראז עבור שעתוק מבחנה. גודל הספרייה התיאורטית או המורכבות היה 431 או כ-1018. השתמשנו בחלק קטן של הספרייה הזאת כדי להכין את בריכת ה-RNA האקראית שלנו (~ 10-12-1015) עבור הניסויים המתוארים להלן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant PTB</td>
			<td>Laboratory Preparation</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0277S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins

רגולציה של ג'ין ממלאת תפקיד חשוב בכל התאים. ההמרה, לאחר ההמרה (או עיבוד RNA), הטרנסלtional והשלבים שלאחר ההעברה משמשים לוויסות גנים ספציפיים. ספציפי לרצף חומצות גרעין-מחייב חלבונים היעד רצפים ספציפיים לשלוט ביטוי גנים מרחביים או זמני. אתרי הכריכה בחומצות גרעין מאופיינים בדרך כלל בניתוחי מבצעים. עם זאת, לחלבונים רבים של עניין אין אתר מחייב ידוע לאפיון כזה. כאן אנו מתארים גישה כדי לזהות אתרי איגוד לא ידועים בעבר עבור חלבונים כריכת RNA. היא כוללת בחירה איטרטיבית והגברה של רצפים החל במאגר רצף אקראי. בעקבות מספר סיבובים של צעדים אלה-תמלול, כריכה והגברה-הרצפים המועשרת מנצנצים כדי לזהות אתרי איגוד מועדפים. הצלחה בגישה זו מפוקחת על ידי שימוש באיגוד מתורבת. לאחר מכן, בתוך מבחנה ובvivo פונקציונלי ניתן להשתמש כדי להעריך את הרלוונטיות הביולוגית של הרצפים שנבחרו. גישה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של אתר מחייב שאינו ידוע בעבר עבור כל חלבון של איגוד RNA שעבורו קיים שיטה להפריד בין מאוגד לחלבון וללא מאוגד.

התצפיות הבאות מדגימות הגברה מוצלחת של בחירה (SELEX). ראשית, ניתחנו את המאגר 0 ואת הרצפים שנבחרו לכריכה לחלבון המשמש את הגישה האיטרטיבית לבחירה. איור 2 מראה כי מערכת החלבונים (ptb) של היונקים המ, מראה כריכה מחייבת בקושי לגילוי 0, אך הזיקה גבוהה למאגר הרצף הנבחר. בק?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins at JoVE.com

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

הספציפיות לרצף היא קריטית. לתקנות הגנים חלבונים רגולטוריות המכירים רצפים ספציפיים חשובים עבור רגולציה גנטית. הגדרת אתרי קשירה פונקציונליים עבור חלבונים כאלה היא בעיה ביולוגית מאתגרת. גישה איטראטיבית לזיהוי של אתר מחייב עבור חלבון של איגוד RNA מתוארת כאן וישימה לכל החלבונים מבוססי RNA.

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

הפרוטוקול משמש עבור מוטגנטיזה רוויה של אתר מחייב חלבון. אם האתר מחייב החלבון שלך אינו ידוע, ניתן לזהות אותו באמצעות פרוטוקול זה. הטכניקה רלוונטית לאבחון וטיפול במחלות.אני מאמין שהפוטנציאל המלא שלו במדעי הביו-רפואה נותר מנוצל במלואו. שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על כל חלבון או תגובה שבהם מולקולות רצויות ניתן להפריד ממולקולות לא רצויות. ודא כי הספרייה היא אקראית כראוי, ולוודא כי במהלך כל שלב כריכה והפרדה לקפל העשרה של מולקולות הרצוי הוא גבוה.זה כרוך בכמה צעדים ופרטים רבים כי הם הפגינו טוב יותר, ולא הסביר במילים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך להרגיש בנוח עם איך להכין ספרייה אקראית, לסנתז בריכת RNA מתחיל, ולבצע תגובה מחייבת מולקולות רצויות ולא רצויות נפרדות כדי להשיג זיקה גבוהה קלסרים ספציפיים. ראשית, לסנתז את פריימר קדימה ואת פריימר הפוך על ידי סינתזה כימית על סינתיסייזר DNA.כמו כן, לסנתז תבנית אוליגונוקלאוטיד ספריה אקראית עם 31 עמדות אקראיות. בצינור PCR, מערבבים תבנית ספריה אקראית של דנ"א מיקרומולרית אחת, פריימר קדמי מיקרומולארי המכיל מקדם פולימראז T7 RNA ו פריימר הפוך, טריס 20 מילימולר ב pH שמונה, 1.5 מילימולאר מגנזיום כלוריד, 50 מילימולר אשלגן כלורי, 1 מיקרוגרם למיליליטר אצטיליטר אצטילייטד סרום אלבומין, שתי יחידות של תאק פולימראז, ו 200 micromolar כל אחד dNTPs. הגדר את מכונת PCR עם חמישה מחזורים של denaturation, חישול, שלבי הרחבה, ואחריו מחזור אחד של הרחבה כדי לצרף את האמרגן לספריית ה- DNA.הגדר תגובת שעתוק 100 מיקרוליטר המכילה מאגר שעתוק T7, דנ"א של מאגר ספריות אקראי של מיקרומולר אחד, DTT חמישה מילימולרים, GTP שני מילימולרים, מילימולרית אחת לכל ATP, CTP ו- UTP, ושתי יחידות למיקרוליטר T7 RNA פולימראז. עכשיו לשים על מגן זכוכית אקריליק וכפפות. הצג רדיואקטיביות על-ידי הוספת 5 מיקרוליטרים או פחות של אלפא-32P UTP לתגובת התמלול לאוטוביוגרפיה.דגירה תערובת התגובה בצינור microcentrifuge במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. לטיהור ג'ל RNA, הכינו ג'ל פוליאקרילמיד 10%. טען דגימות לתוך בארות הג'ל.חשוף את הג'ל לסרט רנטגן, וזהה את מיקום התמלילים על הג'ל וגזור את פרוסת הג'ל. מניחים את פרוסת הג'ל בצינור צנטריפוגה ולשבור לחתיכות קטנות יותר עם קצה homogenizer. מוסיפים חיץ חלבון K כדי לטבול את חתיכות הג'ל.השאירו את הצינור על מטור במשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר. ואז לסובב מיקרוצנטריפוגה במהירות גבוהה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את פסולת ג'ל לשחזר את פתרון החיץ. הוסיפו נפח שווה של פנול-כלורופורם לצינור עם העל-טבעי, המערבולת והצנטריפוגה.חזור על החילוץ עם פנול-כלורופורם עוד פעם אחת ולאחר מכן עם כלורופורם עוד פעם אחת. לאחר מכן, מערבבים את השלב המימי של חיץ proteinase K עם נפח של 1/10 של אצטט נתרן שלוש טוחנות ב pH 5.2, 10 מיקרוגרם של tRNA או 20 מיקרוגרם של גליקוגן, ושניים עד שלושה כרכים של אתנול מאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. השאירו את הצינור במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה.לסובב את הצינור המכיל את הפתרון במשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס במיקרוצנטריפוגה. השליכו את העל-טבעי בזהירות, והוסיפו 70% אתנול כדי לשטוף את גלולת ה-RNA. תסתובב במשך שתיים עד חמש דקות.שאף את האתנול בזהירות, וייבש את גלולת ה-RNA. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מים שטופלו DEPC כדי לבודד את גלולת RNA. השאירו את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון.כדי לאגד חלבון ורנ"א בנפח תגובה של 100 מיקרוליטר, הכינו תחילה טריס הידרוכלוריד 10 מילימולארי ב-pH 7.5 המכיל אשלגן כלורי 50 מ"ל, DTT מילימולר אחד, 09 מיקרוגרם למיקרוליטר סרום בסרום אלבומין, 5 יחידות למיקרוליטר RNAsin, 15 מיקרוגרם למיקרוליטר tRNA, ו EDTA מילימילאר אחד. לאחר מכן הוסיפו 30 מיקרוליטרים של חלבון רקומביננטי PTB ו-10 מיקרוליטרים של רנ"א מהבריכה המתאימה. מניחים את הצינורות המכילים את התגובות מחייב בלוק טמפרטורה במשך כ 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, חלק את ה- RNA המאוגד מה- RNA הלא מאוגד באמצעות ארבעה סבבים של בחירה והגברה. ראשית, לסנן את מדגם 100 מיקרוליטר בטמפרטורת החדר באמצעות מסנן nitrocellulose מחובר סעפת ואקום. תסביך חלבון ה-RNA נשאר על המסנן.בעזרת סכין גילוח סטרילי, קוצצים את המסנן לרסיסים, ומכניסים אותם לצינור צנטריפוגה. טובלים את חתיכות המסנן במאגר proteinase K, ומ מניחים אותו על למשך שלוש שעות לפחות או לילה כדי לשחזר את ה- RNA. כדי להפוך את דגימת ה-RNA לדה-פרוטאין, הוסיפו נפח שווה של פנול-כלורופורם, מערבולת ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות גבוהה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.להשיג את השלב הממיקי, ולחלץ עם כלורופורם שוב. לאחר מכן, מערבבים את supernatant עם 1/10 נפח של אצטט נתרן שלוש טוחנות ב pH 5.2 ושניים עד שלושה כרכים של אתנול מוחלט. השאירו את הצינור במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה אותו במהירות גבוהה במשך 10 דקות.חזרו על שלבי הכביסה והביבוש עם 70% אתנול, ובודדו את ה-RNA במים שטופלו ב-DEPC. לאחר הסיבוב הראשון של מבחן איגוד המסנן, לבצע שלושה סיבובים נוספים. לאחר מכן, בצעו שני סבבים של שעתוק, כריכה והגברה כדי להפריד את שברי ה-RNA הקשורים לחלבון מהשברים הלא מאוגדים.שידנו מראש ג'ל פוליאקרילמיד מקורי של 5% עם יחס אקרילאמיד-ביס-אקרילאמיד של 60 ל-1 במאגר TBE 5x. לאחר מכן הגדר את תגובת קשירה חלבון RNA. מניחים את הג'ל במכשיר אלקטרופורזה מלא חיץ TBE 5x בחדר קר בארבע מעלות צלזיוס.החל 250 וולט במשך 15 דקות, ואת פיפטה התגובה מחייב לתוך בארות שונות. לאחר מכן לשבר נוסף את RNA מאוגד מן RNA מאוגד על ידי הפעלת אלקטרופורזה ב 250 וולט במשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, לחשוף את הג'ל לסרט רנטגן, ולזהות את המיקום של RNA כבול באמצעות אוטוביוגרפיה.חותכים את פרוסת הג'ל עם RNA כרוך, ולהכניס אותו לתוך צינור. מרסקים את פרוסת הג'ל, וגורר במאגר proteinase K במשך שלוש שעות או לילה. חזור על החילוץ עם פנול-כלורופורם וכלורופורם כפי שתואר קודם לכן.לסנתז cDNA מן RNA מומס. הכינו 20 מיקרוליטרים של תגובה, כולל שני מיקרוליטרים של חיץ RT 10x, שני מיקרוליטרים של תעתיק הפוך AMV, מיקרוליטר אחד של פריימר הפוך, חמישה מיקרוליטרים של מים, ו -10 מיקרוליטרים של ה- RNA המומס. דגירה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.להגביר את cDNA באמצעות 20 עד 25 מחזורי PCR כפי שתואר קודם לכן. חזור על תהליך סינתזת RNA, כריכת חלבון והפרדת שברים הקשורים לחלבון ובלתי מאוגדים. כדי לנתח את כריכת החלבון, השתמשו בהסטת הג'ל או בהסטת כריכת המסנן כדי לקבוע זיקה מחייבת וספניות לבריכות נבחרות או רצפים בודדים בתוך כל בריכה.השתמש באוטוביוגרפיה או בתמונה של זרחן כדי לזהות ולכרות רצועות בשבר המאוגד ובשבר הלא מאוגד. המשך את הפרוטוקול עם שכפול ויישור רצף. במחקר זה הושגה הגברה מוצלחת של הבחירה.חלבון מחייב בדרכי פוליפרימידין של יונקים עם ריכוז חלבון גבוה פי 300 מראה בקושי קשירה לבריכה אפס רצף אבל זיקה גבוהה עבור מאגר הרצף שנבחר. הגברה-בחירה זוהתה בהצלחה על חלבונים מחייבי RNA עם אתר מועדף או מחייב קונצנזוס. תוספת של PTB רקומביננטי, אשר נקשר לאתר במעלה הזרם שלושה פריים splice, מוביל להפעלה של אתר splice חלופי או במורד הזרם שלוש פריים.לעומת זאת, תוספת של hnRNP C רקומביננטי מוביל לדיכוי של שני אתרי splice שלושה ראשים. תוספת של גורם שיפוש כללי רקומביננטי U2AF65 הפך את hnRNP C-מתווך שלושה ראשים באתר דיכוי אתר splice. חשוב לזכור כי ספרייה אקראית טובה ותנאים מחייבים נאותים ה שמעניקים העשרה גבוהה בכל שלב מחייב נחוצים להצלחה.ניתן להשתמש בבדיקות תפקודיות מתאימות ובבדיקות in vivo כדי לאמת את תוצאת גישה זו. בתחום ביטוי הגנים, פונקציות של חלבונים רבים נחקרו באמצעות טכניקה זו. חשוב להשתמש בכפפות וחותם רדיואקטיבי להגנה תוך כדי עבודה עם פוליאקרילמיד ורדיואקטיביות.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...