Name: exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00
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著者は、過去の資金のために国立衛生研究所に感謝します。

注:図 1は、反復選択増幅 (SELEX) プロセスの主要な手順の概要を示しています。
1. ランダムライブラリテンプレートの生成
<ol><li>DNAシンセサイザー上の化学合成により、前方プライマー5'-GTAATCAGGTCAGATCTGATCCA-3'と逆プライマー5'-GCGACGGATCCAAGCTTCA-3'を合成します。 注:プライマーとランダムライブラリは、商業的に合成することができます。</l...

<ol>
	<li>Pribnow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+an+RNA+polymerase+binding+site+at+an+early+T7+promoter.">Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).</li><li>Breathnach, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+expression+of+eucaryotic+split+genes+coding+for+proteins.">Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).</li><li>Wickens, M., Stephenson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+conserved+AAUAAA+sequence:+four+AAUAAA+point+mutants+prevent+messenger+RNA+3'+end+formation.">Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation.</a> Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAcompete+methodology+and+application+to+determine+sequence+preferences+of+unconventional+RNA-binding+proteins.">RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins.</a> Methods. 118, 3-15 (2017).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+massively+parallel+SELEX+for+characterization+of+human+transcription+factor+binding+specificities.">Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities.</a> Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures.">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).</li><li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA.">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (1989).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+polypyrimidine+tract-binding+protein+is+necessary+for+spermatid+individualization.">Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).</li><li>Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+RNA+recognition+motif+3+of+U2+snRNA+auxiliary+factor+(U2AF(65))+is+essential+in+vivo+but+dispensable+for+activity+in+vitro.">The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro.</a> RNA. 10 (65), 240-253 (2004).</li><li>Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determinants+of+RNA-binding+specificity+of+the+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C+proteins.">The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins.</a> J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).</li><li>Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+Sex-lethal+antagonizes+the+splicing+factor+U2AF+to+regulate+alternative+splicing+of+transformer+pre-mRNA.">The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA.</a> Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).</li><li>Wilson, C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+fluorophore-specific+DNA+aptamer+with+weak+redox+activity.">Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.</a> Chemistry &amp; Biology. 5 (11), 609-617 (1998).</li><li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflections+of+a+Darwinian+Engineer.">Reflections of a Darwinian Engineer.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).</li><li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development.">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).</li><li>Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Bind-n-Seq:+quantitative+assessment+of+the+sequence+and+structural+binding+specificity+of+RNA+binding+proteins.">RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins.</a> Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).</li><li>Szeto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID-SELEX+for+RNA+aptamers.">RAPID-SELEX for RNA aptamers.</a> PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).</li><li>Rohloff, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Ligands+With+Protein-like+Side+Chains:+Modified+Aptamers+and+Their+Use+as+Diagnostic+and+Therapeutic+Agents.">Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).</li><li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+multiplexed+proteomic+technology+for+biomarker+discovery.">Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).</li><li>Zhuo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+SELEX+Technology+and+Aptamer+Applications+in+Biomedicine.">Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li><li>Blind, M., Blank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+Selection+Technology+and+Recent+Advances.+Molecular+Therapy.">Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy.</a> Nucleic Acids. 4, e223 (2015).</li><li>Jijakli, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+selection+world.">The in vitro selection world.</a> Methods. 106, 3-13 (2016).</li></ol>

核酸結合タンパク質は、動物および植物の発達の重要な調節剤である。SELEX手順の重要な要件は、タンパク質結合および非結合RNA画分分を分離するために使用できるアッセイの開発です。原理的には、このアッセイは、フィルタ結合アッセイ、ゲル移動シフトアッセイ、または組換えタンパク質、精製タンパク質、またはタンパク質複合体に対するマトリックス結合アッセイ19</s...

細胞生物学では、遺伝子調節が中心的な役割を果たします。遺伝子発現経路に沿った1つまたは複数のステップで、遺伝子は調節される可能性を持つ。これらのステップには、転写(開始、伸び、終了)、スプライシング、ポリアデニル化または3'エンド形成、RNAエクスポート、mRNA翻訳、および一次転写の減衰/局在化が含まれます。これらのステップでは、核酸結合タンパク質は遺伝子調節を調節する。このようなタンパク質に対する結合部位の同定は、遺伝子制御を研究する上で重要な側面である。突然変異解析と系統配列比較は、プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化元素、および翻訳シグナル1などの核酸における調節配列またはタンパク質結合部位を発見するために使用されてきた。2,3,4.
プレmRNAスプライシングは、遺伝子発現および調節中に不可欠なステップです。ヒトの哺乳類遺伝子を含む哺乳類の遺伝子の大半は、イントロンを持っています。これらの転写物の大部分は、代わりにスプライスされ、同じ遺伝子または一次転写産物から複数のmRNAおよびタンパク質アイソフォームを産生する。これらのアイソフォームは、細胞生物学において細胞特異的および発達的役割を持つ。5'スプライス部位、分岐点、およびポリピリミジン管/3'スプライス部位は、規制の対象となる重要なスプライシング信号です。否定的な規制では、そうでなければ強いスプライス部位が抑圧され、正の調節では弱いスプライス部位が活性化される。これらのイベントの組み合わせは、機能的に異なるアイソフォームの多くを生成します。RNA結合タンパク質は、これらの代替スプライシングイベントにおいて重要な役割を果たします。
多数のタンパク質が知られており、その結合部位またはRNA標的は5、6を同定されたままである。調節タンパク質を下流の生物学的標的または配列にリンクすることは、多くの場合、複雑なプロセスです。このようなタンパク質の場合、標的RNAまたは結合部位の同定は、その生物学的機能を定義する上で重要なステップである。結合部位が同定されると、標準的な分子および生化学的分析を用いてさらに特徴付けることができる。
ここで説明する方法には、2 つの利点があります。まず、目的のタンパク質に対して未知の結合部位を同定することができる。第二に、このアプローチの付加的な利点は、同時に飽和変異を可能にし、それ以外の場合は結合部位内の配列要件に関する同等の情報を得るために労働集約的であろうということです。従って、RNAのタンパク質結合部位を同定するためのより速く、より簡単で、より低コストのツールを提供する。本来、このアプローチ(EXponential enrichmentによるリガンドのSELEXまたは系統的進化)は、独自のmRNAにおけるリボソーム結合部位と重複するバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ(遺伝子43タンパク質)の結合部位を特徴付けるために使用された。バインディング部位には 8 ベースのループ シーケンスが含まれており、分析7の 65,536 個のランダム化バリアントを表します。第二に、このアプローチはまた、異なる染料に対する特定の結合部位またはアプタマーが約1013配列8のプールから選択できることを示すために独立して使用された。実際、このアプローチは、タンパク質、小分子、細胞などの多数のリガンドを結合するためのアプタマー(RNAまたはDNA配列)を同定し、触媒9のために多くの異なる文脈で広く使用されてきました。一例として、アプタマーは、カフェイン10中の1つのメチル基の存在によって異なる2つのキサンチン誘導体、カフェインおよびテオフィリンを区別することができる。我々は、このアプローチ(SELEXまたは反復選択増幅)を広く使用して、RNA結合タンパク質がスプライシングまたはスプライシング調節11でどのように機能するかを研究しました。
ランダムライブラリ:我々は31ヌクレオチドのランダムライブラリを使用しました。ランダムライブラリの長さの考慮は、一般的なスプライシング係数U2AF65が分岐点配列と3'スプライス部位の間のシーケンスに結合するという考えに大まかに基づいていました。平均して、メタゾンにおけるこれらのスプライシング信号間の間隔は、20〜40ヌクレオチドの範囲にある。別のタンパク質セックス致死性は、その標的前mRNA、変圧器の3'スプライス部位付近の不十分な特徴付け調節配列に結合することが知られていた。したがって、我々は31ヌクレオチドのランダム領域を選択し、制限酵素部位を有するプライマー結合部位によって横たわって、インビトロ転写のためのT7 RNAポリメラーゼプロモーターのPCR増幅および付着を可能にした。理論的なライブラリのサイズまたは複雑さは 431または約 1018.このライブラリのほんの一部を使用して、以下に説明する実験のためにランダムRNAプール(~10 12-1015)を準備しました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant PTB</td>
			<td>Laboratory Preparation</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0277S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins

遺伝子調節はすべての細胞で重要な役割を果たしています。転写、転写後(またはRNA処理)、翻訳、および翻訳後のステップは、特定の遺伝子を調節するために使用されます。配列特異的な核酸結合タンパク質は、空間的または時間的遺伝子発現を制御する特定の配列を標的とする。核酸中の結合部位は、典型的には変異分析によって特徴付けられる。しかしながら、目的の多数のタンパク質は、そのような特徴付けのための既知の結合部位を有していない。ここでは、RNA結合タンパク質に対する未知の結合部位を同定するアプローチについて説明する。これは、ランダム化されたシーケンスプールから始まるシーケンスの反復的な選択と増幅を含みます。これらのステップ転写、結合、増幅のいくつかのラウンドに続いて、濃縮された配列は、好ましい結合部位を識別するために配列される。このアプローチの成功は、インビトロ結合アッセイを用いてモニターされる。続いて、インビトロおよびインビボ機能アッセイを用いて、選択した配列の生物学的関連性を評価することができる。このアプローチにより、タンパク質結合型および非結合RNAを分離するアッセイが存在するRNA結合タンパク質に対して、以前に未知の結合部位の同定と特徴付けが可能になります。

以下の観察は、選択増幅(SELEX)の成功を示しています。まず、プール0と選択した配列を分析し、反復選択増幅アプローチに使用するタンパク質に結合する。図2は、哺乳動物ポリピリミジン管結合タンパク質(PTB)が、選択された配列プールに対してプール0配列に対してほとんど検出可能であるが、高い親和性を示すことを示す。選択したプールに?...

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Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

配列特異性は遺伝子調節に不可欠です。特定の配列を認識する調節タンパク質は、遺伝子調節にとって重要です。このようなタンパク質に対する機能的結合部位の定義は、困難な生物学的問題である。RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための反復的アプローチをここに説明し、すべてのRNA結合タンパク質に適用可能である。

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

このプロトコルは、タンパク質結合部位の飽和変異生成に使用される。タンパク質結合部位が不明な場合は、このプロトコルを使用して同定できます。この技術は、疾患診断および治療に関連しています。生物医学の可能性は、まだ十分に活用されていると思います。この方法は、望ましい分子が望ましくない分子から分離され得る任意のタンパク質または反応に広く適用することができる。ライブラリが適切にランダム化されていることを確認し、各結合および分離ステップの間に、所望の分子のフォールド濃縮が高いことを確認してください。それは言葉で説明するのではなく、いくつかのステップと多くの詳細を含みます。このビデオを見た後、ランダムライブラリを準備し、開始RNAプールを合成し、高い親和性と特異的バインダーを得るために望ましい分子と望ましくない分子を分離する結合反応を行う方法に慣れるはずです。まず、DNAシンセサイザー上で化学合成によりフォワードプライマーとリバースプライマーを合成する。また、31のランダム化された位置を用いてランダムライブラリオリゴヌクレオチドテンプレートを合成する。PCRチューブで、1マイクロモルDNAランダムライブラリテンプレートを混合し、 T7 RNAポリメラーゼプロモーターおよびリバースプライマーを含む1マイクロモルフォワードプライマー、pH8で20ミリモルトリス、1.5ミリモル塩化マグネシウム、50ミリモル塩化カリウム、1-ミリグラムのアセチル化ウシ血清アルブミン、タクポリメラーゼの2単位、および200マイクロモル各dNT5サイクルの変性、アニーリング、および延長ステップでPCRマシンを設定し、続いて1サイクルの延長を行い、プロモーターをDNAライブラリに取り付けます。T7転写バッファー、1マイクロモルランダムライブラリプールDNA、5ミリモルDTT、2ミリモルGTP、ATP、CTP、およびUTPのそれぞれ1ミリモル、および2単位/マイクロリットルT7 RNAポリメラーゼを含む100マイクロリットル転写反応を設定します。今アクリルガラスの盾と手袋を着用してください。5マイクロリットル以下のα-32P UTPをオートラジオグラフィー用転写反応に添加して放射能を導入する。反応混合物をマイクロ遠心チューブに37°Cで2時間インキュベートします。RNAをゲル化するために、10%変性ポリアクリルアミドゲルを調製する。サンプルをゲルのウェルにロードします。ゲルをX線フィルムに露出させ、ゲル上の転写物の位置を特定し、ゲルスライスを切り取ります。ゲルスライスを遠心管に入れ、ホモジナイザーチップで小さく割ります。プロテイナーゼKバッファーを加えた後、ゲル片を浸します。チューブを常温で少なくとも2時間は、ヌテレーターに置いたままにしておきます。次に、高速マイクロ遠心分離機を室温で5分間回転させ、ゲルデブリを取り除き、緩衝液を回収します。上清、渦、遠心分離機でチューブに等量のフェノールクロロホルムを加えます。フェノールクロロホルムをもう一度、クロロホルムでもう一度抽出を繰り返します。次に、pH 5.2で酢酸3モルナトリウムの1/10容量、10マイクログラムのtRNAまたは20マイクログラムのグリコーゲン、およびマイナス20°Cで貯蔵されたエタノールの2〜3ボリュームとプロテナーゼKバッファーの水相を混合します。チューブをマイナス80度で1時間放置します。マイクロ遠心分離機で摂氏4度で5〜10分間溶液を含むチューブを回転させます。上清を慎重に捨て、70%エタノールを加えてRNAペレットをすすきます。2~5分間スピンします。エタノールを注意深く吸気し、RNAペレットを空気乾燥する。次に、DEPCで処理した50マイクロリットルの水を加え、RNAペレットを可溶化します。サンプルはマイナス20°Cに置いて保管してください。100マイクロリットルの反応体積でタンパク質とRNAを結合するために、最初に50ミリモルカリウムクロリド、1ミリモルDTT、09マイクログラム/マイクロリットルウシ血清アルブミン、5単位/マイクロリットルRNAsin、15マイクログラム/マイクロリットル、15マイクログラムの1マイクロリットル、15マイクログラムを含むpH 7.5で10ミリモルトリス塩酸塩を調製する。次に、組換えタンパク質PTBの30マイクロリットルと適切なプールから10マイクロリットルのRNAを加えます。結合反応を含むチューブを温度ブロックに25°Cで約30分間入れます。次に、結合したRNAを非結合RNAから4ラウンドの選択および増幅を分画します。まず、真空マニホールドに取り付けられたニトロセルロースフィルターを介して、室温で100マイクロリットルのサンプルをフィルター処理します。RNAタンパク質複合体は、フィルター上に残っています。滅菌カミソリの刃で、フィルターを破片に刻み、遠心分離管に挿入します。フィルター片をプロテナーゼKバッファーに浸し、最低3時間または一晩タンブラーに置いてRNAを回収します。RNAサンプルを脱タンパク化するには、等量のフェノールクロロホルム、渦、そして室温で5分間高速で遠心分離機を加えます。水相を得て、再びクロロホルムで抽出する。その後、pH5.2で酢酸3モルの1/10容量と絶対エタノールの2〜3ボリュームと上清を混合します。マイナス80度の冷凍庫に30分間チューブを残し、10分間高速で遠心分離します。洗浄と乾燥の工程を70%エタノールで繰り返し、DEPC処理水にRNAを可溶化します。フィルター結合アッセイの第1ラウンド後、さらに3ラウンドを実施する。次に、2ラウンドの転写、結合、および増幅を行い、タンパク質結合RNA画分を非結合画分から分離する。5x TBEバッファーに60対1のアクリルアミド-ビスアクリルアミド比を有する天然5%ポリアクリルアミドゲルをプレキャストする。次にRNA-タンパク質結合反応をセットアップします。5倍のTBEバッファーを充填した電気泳動装置にゲルを摂氏4度の冷たい部屋に入れます。250ボルトを15分間塗布し、異なるウェルにピペットを結合反応させた。次に、250ボルトで1〜2時間電気泳動を行い、結合したRNAから結合したRNAをさらに分画する。次に、ゲルをX線フィルムに露出させ、オートラジオグラフィーを用いて結合RNAの位置を特定する。結合RNAでゲルスライスを切り取り、チューブに挿入します。ゲルスライスを粉砕し、プロテナーゼKバッファー中で3時間または一晩インキュベートする。前述のようにフェノールクロロホルムとクロロホルムで抽出を繰り返します。溶解したRNAからcDNAを合成する。20マイクロリットルの10x RTバッファー、2マイクロリットルのAMV逆転写酵素、1マイクロリットルの逆プライマー、5マイクロリットルの水、および10マイクロリットルの溶解RNAを含む20マイクロリットルの反応を調製します。摂氏42度で60分間インキュベートします。前述のように20~25のPCRサイクルを使用してcDNAを増幅します。RNA合成、タンパク質結合、およびタンパク質結合および結合されていない分画の分離のプロセスを繰り返します。タンパク質結合を解析するには、ゲル移動性シフトアッセイまたはフィルター結合アッセイを使用して、各プール内の選択されたプールまたは個々の配列の結合親和性および特異性を決定します。オートラジオグラフィーまたは蛍光体イメージャーを使用して、バインドされた分数と非結合分数のバンドを検出して定量化します。クローン作成とシーケンスのアライメントを使用して、プロトコルを続行します。本研究では、選択増幅が成功した。哺乳類ポリピリミジントラクト結合タンパク質は300倍高いタンパク質濃度を有し、プールゼロ配列への結合はほとんど検出できないが、選択された配列プールに対する親和性が高いことを示す。選択増幅は、好ましいまたはコンセンサス結合部位を有するRNA結合タンパク質で同定に成功した。上流の3つの素数のスプライスサイトに結合する組換えPTBの付加は、代替または下流の3素数スプライスサイトの活性化をもたらす。対照的に、組換えhnRNP Cを添加すると、両方の3素数スプライス部位の抑制が生じる。組換え一般スプライシング係数U2AF65の添加は、hnRNP C媒介三原性スプライス部位抑制を逆転させた。適切な無作為化ライブラリと、各バインドステップで高い倍の濃縮を与える適切なバインド条件が成功するために必要であることを覚えておくことが重要です。適切な機能アッセイおよびインビボ試験を使用して、このアプローチの結果を検証することができます。遺伝子発現の分野では、この技術を用いて多くのタンパク質の機能が検討されている。ポリアクリルアミドや放射能を使用しながら、保護のために手袋と放射性シールを使用することが重要です。

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

哺乳類細胞におけるメジャー クロマチン アクセシビリティ規制要素のホルムアルデヒドによる分離

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...