Name: exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00
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저자는 과거 자금조달을 위한 건강의 국가 학회를 감사합니다.

참고: 그림 1은 SELEX(반복 선택 증폭) 프로세스의 주요 단계에 대한 요약을 제공합니다.
1. 랜덤 라이브러리 템플릿 생성
<ol><li>전방 프라이머 5'- GTAATACGActATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3'와 역프라이머 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3'를 DNA 신디사이저에 화학 합성하여 합성합니다. 참고: 프라이머와 랜덤 라이브러리는 상업적으로 합성할 수 있습니다.</li>
	<li>임의 ?...

<ol>
	<li>Pribnow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+an+RNA+polymerase+binding+site+at+an+early+T7+promoter.">Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).</li><li>Breathnach, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+expression+of+eucaryotic+split+genes+coding+for+proteins.">Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).</li><li>Wickens, M., Stephenson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+conserved+AAUAAA+sequence:+four+AAUAAA+point+mutants+prevent+messenger+RNA+3'+end+formation.">Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation.</a> Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAcompete+methodology+and+application+to+determine+sequence+preferences+of+unconventional+RNA-binding+proteins.">RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins.</a> Methods. 118, 3-15 (2017).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+massively+parallel+SELEX+for+characterization+of+human+transcription+factor+binding+specificities.">Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities.</a> Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures.">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).</li><li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA.">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (1989).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+polypyrimidine+tract-binding+protein+is+necessary+for+spermatid+individualization.">Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).</li><li>Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+RNA+recognition+motif+3+of+U2+snRNA+auxiliary+factor+(U2AF(65))+is+essential+in+vivo+but+dispensable+for+activity+in+vitro.">The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro.</a> RNA. 10 (65), 240-253 (2004).</li><li>Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determinants+of+RNA-binding+specificity+of+the+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C+proteins.">The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins.</a> J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).</li><li>Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+Sex-lethal+antagonizes+the+splicing+factor+U2AF+to+regulate+alternative+splicing+of+transformer+pre-mRNA.">The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA.</a> Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).</li><li>Wilson, C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+fluorophore-specific+DNA+aptamer+with+weak+redox+activity.">Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.</a> Chemistry &amp; Biology. 5 (11), 609-617 (1998).</li><li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflections+of+a+Darwinian+Engineer.">Reflections of a Darwinian Engineer.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).</li><li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development.">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).</li><li>Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Bind-n-Seq:+quantitative+assessment+of+the+sequence+and+structural+binding+specificity+of+RNA+binding+proteins.">RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins.</a> Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).</li><li>Szeto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID-SELEX+for+RNA+aptamers.">RAPID-SELEX for RNA aptamers.</a> PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).</li><li>Rohloff, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Ligands+With+Protein-like+Side+Chains:+Modified+Aptamers+and+Their+Use+as+Diagnostic+and+Therapeutic+Agents.">Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).</li><li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+multiplexed+proteomic+technology+for+biomarker+discovery.">Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).</li><li>Zhuo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+SELEX+Technology+and+Aptamer+Applications+in+Biomedicine.">Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li><li>Blind, M., Blank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+Selection+Technology+and+Recent+Advances.+Molecular+Therapy.">Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy.</a> Nucleic Acids. 4, e223 (2015).</li><li>Jijakli, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+selection+world.">The in vitro selection world.</a> Methods. 106, 3-13 (2016).</li></ol>

핵산 결합 단백질은 동물 및 식물 개발의 중요한 조절자입니다. SELEX 절차에 대한 주요 요구 사항은 단백질 결합 및 언바운드 RNA 분획을 분리하는 데 사용할 수 있는 분석법의 개발입니다. 원칙적으로, 이러한 분석법은 재조합 단백질, 정제 단백질, 또는 단백질 복합체에 대한 필터 결합 분석, 겔 이동성 이동 분석, 또는 매트릭스 결합 분석기(19)와 같은 시험관내 결합 분석기일 수...

세포 생물학에서, 유전자 조절은 중앙 역할을 합니다. 유전자 발현 경로를 따라 하나 또는 여러 단계에서, 유전자는 조절될 가능성이 있다. 이러한 단계에는 전사(개시, 신장 및 종결)뿐만 아니라 접합, 폴리아데닐화 또는 3' 말단 형성, RNA 수출, mRNA 번역 및 1차 전사체의 붕괴/국소화가 포함됩니다. 이 단계에서, 핵산 결합 단백질은 유전자 조절을 조절한다. 이러한 단백질에 대한 결합 부위의 식별은 유전자 조절을 연구하는 중요한 측면이다. 돌연변이 분석 및 계통유전학 적 서열 비교는 프로모터, 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 요소 및 번역 신호와 같은 핵산에서 조절 서열 또는 단백질 결합 부위를 발견하기 위해 사용되어 왔다1. 2개 , 3개 , 4.
사전 mRNA 접합은 유전자 발현 및 조절 동안 필수적인 단계이다. 포유류 유전자의 대다수는, 인간에 있는 사람들을 포함하여, 인트론이 있습니다. 이 전사체의 큰 분획은 대안적으로 접합되고, 동일한 유전자 또는 1차 전사체로부터 다중 mRNA 및 단백질 이소폼을 생성한다. 이 이소양식에는 세포 생물학에 있는 세포 특정 그리고 발달 역할이 있습니다. 5' 스플라이스 사이트, 분기점 및 폴리피리미딘-요로/3' 접합 사이트는 규제대상인 중요한 접합 신호입니다. 부정적인 규제에서, 그렇지 않으면 강한 스플라이스 사이트는 억압되는 반면, 긍정적 인 규제에서 그렇지 않으면 약한 스플라이스 사이트가 활성화됩니다. 이러한 이벤트의 조합은 기능적으로 구별되는 등소폼의 과다를 생성합니다. RNA 결합 단백질은 이 대체 접합 사건에서 중요한 역할을 합니다.
수많은 단백질은 그의 결합 부위 또는 RNA 표적이5,6으로식별되는 것으로 알려져 있다. 그들의 다운스트림 생물학 표적 또는 서열에 규정한 단백질을 연결하는 것은 수시로 복잡한 프로세스입니다. 이러한 단백질의 경우, 그들의 표적 RNA 또는 결합 부위의 식별은 그들의 생물학적 기능을 정의하는 데 중요한 단계이다. 결합 부위가 확인되면 표준 분자 및 생화학 분석을 사용하여 더욱 특성화 될 수 있습니다.
여기에 설명된 접근 방식에는 두 가지 장점이 있습니다. 먼저, 관심 있는 단백질에 대해 이전에 알려지지 않은 결합 부위를 식별할 수 있다. 둘째, 이 접근법의 추가적인 장점은 동시에 채도 돌연변이 발생을 허용한다는 것입니다. 따라서 RNA에서 단백질 결합 부위를 식별하는 더 빠르고, 쉽고, 비용이 적게 드는 도구를 제공합니다. 원래, 이러한 접근법(SelEX 또는 EXponential 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화)은 자체 mRNA에서 리보솜 결합 부위와 겹치는 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제(gene 43 단백질)에 대한 결합 부위를 특성화하는 데 사용되었다. 바인딩 사이트에는 분석7에대한 65,536 개의 무작위 변형을 나타내는 8 base 루프 시퀀스가 포함되어 있습니다. 둘째, 상기 접근법은 또한 상이한 염료에 대한 특정 결합 부위 또는 압타머가 약 1013 서열 8의 풀로부터 선택될 수 있음을 보여주기 위해 독립적으로 사용되었다. 실제로, 이러한 접근법은 단백질, 소분자 및 세포와 같은 수많은 리간드를 결합하기 위한 aptamers(RNA 또는 DNA 서열)를 식별하고, 촉매9를위해 많은 상이한 문맥에서 광범위하게 사용되어 왔다. 일례로, 압타머는 카페인10에서하나의 메틸 그룹의 존재에 의해 다른 두 크산틴 유도체, 카페인 및 테오필린 을 구별 할 수 있습니다. 우리는 RNA 결합 단백질이 접합 또는 접합 조절11에서어떻게 작동하는지 연구하기 위해이 접근법 (SELEX 또는 반복 선택 증폭)을 광범위하게 사용했으며, 이는 아래 논의의 기초가 될 것입니다.
무작위 라이브러리: 우리는 31개의 뉴클레오티드의 무작위 라이브러리를 사용했습니다. 랜덤 라이브러리에 대한 길이 고려는 일반적인 접합 계수 U2AF65가 분기 점 서열과 3' 스플라이스 사이트 사이의 서열에 결합한다는 생각에 느슨하게 기초했다. 평균적으로, 메타조안에서 이러한 접합 신호 사이의 간격은 20~40개의 뉴클레오티드 의 범위에 있다. 또 다른 단백질성-치사성은 표적 프리-mRNA, 변압기의3' 스플라이스 부위 근처의 불쌍한 특징조절 서열에 결합하는 것으로 알려졌다. 따라서, 우리는 시험관 내 전사에 대한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 PCR 증폭 및 부착을 허용하도록 제한 효소 부위를 가진 프라이머 결합 부위에 의해 측면에 있는 31개의 뉴클레오티드의 무작위 영역을 선택했다. 이론적 라이브러리 크기 또는 복잡성은 431 또는 약 1018이었다. 우리는 아래에 설명된 실험을 위해 무작위 RNA 풀(~10 12-1015)을준비하기 위해 이 라이브러리의 작은 부분을 사용했습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant PTB</td>
			<td>Laboratory Preparation</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0277S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins

유전자 조절은 모든 세포에서 중요한 역할을 합니다. 전사, 전사 후 (또는 RNA 처리), 번역 및 번역 후 단계는 특정 유전자를 조절하는 데 사용됩니다. 서열 특이적 핵산 결합 단백질은 공간적 또는 시간적 유전자 발현을 조절하기 위해 특정 서열을 표적으로 한다. 핵산의 결합 부위는 전형적으로 돌연변이 분석을 특징으로 한다. 그러나, 관심있는 수많은 단백질은 그러한 특성화에 대한 알려진 결합 부위가 없다. 여기에서 우리는 RNA 결합 단백질을 위한 이전에 알려지지 않은 결합 사이트를 확인하기 위하여 접근을 기술합니다. 그것은 무작위 시퀀스 풀로 시작하는 시퀀스의 반복적 선택 및 증폭을 포함한다. 이러한 단계-전사, 결합 및 증폭의 여러 라운드에 이어 농축된 서열은 바람직한 결합 부위를 식별하기 위해 서열화된다. 이 접근법의 성공은 시험관 내 결합 성 결합 방법을 사용하여 모니터링됩니다. 이어서, 생체외 및 생체내 기능성 시험은 선택된 서열의 생물학적 관련성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이 접근법은 단백질 결합 및 언바운드 RNA를 분리하는 분석이 존재하는 임의의 RNA 결합 단백질에 대해 이전에 알려지지 않은 결합 부위의 식별 및 특성화를 허용한다.

다음 관찰은 성공적인 선택 증폭(SELEX)을 보여줍니다. 먼저, 반복적 선택 증폭 접근법에 사용되는 단백질에 결합하기 위한 풀 0 및 선택된 서열을 분석했다. 도 2는 포유류 폴리피리미딘-관제 단백질(PTB)이 선택된 서열 풀에 대해 풀 0 서열에 거의 검출 가능한 결합을 나타내지만 높은 친화성을 나타낸다. 선택된 풀에 사용되는 것보다 결합을 위해 약 30...

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Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

규제 RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위를 식별하기 위한 서열 공간 탐색

서열 특이성은 유전자 조절에 매우 중요합니다. 특정 서열을 인식하는 조절 단백질은 유전자 조절에 중요합니다. 이러한 단백질에 대한 기능적 결합 부위를 정의하는 것은 어려운 생물학적 문제입니다. RNA 결합 단백질에 대한 결합 부위의 식별을 위한 반복적 접근법은 여기에 기재되어 있으며 모든 RNA 결합 단백질에 적용가능하다.

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

프로토콜은 단백질 결합 부위의 포화 돌연변이 발생에 사용됩니다. 단백질 결합 부위가 알려지지 않은 경우 이 프로토콜을 사용하여 식별할 수 있습니다. 이 기술은 질병 진단 및 치료에 대한 관련성을 가지고 있습니다.나는 생물 의학 과학에 있는 그것의 잠재력이 완전히 착취될 남아 있다고 믿습니다. 이 방법은 원하는 분자가 바람직하지 않은 분자로부터 분리 될 수있는 단백질 이나 반응에 광범위하게 적용 될 수 있습니다. 라이브러리가 제대로 무작위화되었는지 확인하고 각 결합 및 분리 단계 동안 원하는 분자의 접이식 농축이 높은지 확인하십시오.그것은 단어로 설명하기보다는 더 잘 입증 되는 몇 가지 단계와 많은 세부 사항을 포함한다. 이 비디오를 시청한 후에는 무작위 라이브러리를 준비하고, 시작 RNA 풀을 합성하고, 높은 친화력과 특정 바인더를 얻기 위해 원하는 분자와 원치 않는 분자를 분리하는 결합 반응을 수행하는 방법에 익숙해져야 합니다. 먼저, DNA 신디사이저상화학합성에 의한 전방 프라이머와 역프라이머를 합성한다.또한 무작위 라이브러리 올리고뉴클레오티드 템플릿을 31개의 무작위 위치로 합성합니다. PCR 튜브에서, 하나의 마이크로 몰라 DNA 임의의 라이브러리 템플릿을 혼합, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 리버스 프라이머를 함유한 1마이크로몰러 포워드 프라이머, pH 8에서 20밀리머 트리스, 염화 마그네슘 1.5밀리알륨, 염화칼륨 50밀리알륨, 밀리리터 아세트소 스루메닌 1마이크로그램, Tqa 20의 마이크로그램 을 함유하고 있습니다. 5주기의 디내튜레이션, 어닐링 및 확장 단계로 PCR 기계를 설정하고, 그 다음에 는 프로모터를 DNA 라이브러리에 부착하기 위한 확장의 한 주기가 뒤따릅니다.T7 전사 완충, 1마이크로몰러 무작위 라이브러리 풀 DNA, 5밀리머 DTT, 2밀리머 GTP, 각각 ATP, CTP 및 UTP 1밀리머, 마이크로리터 T7 RNA 폴리머를 포함하는 100 마이크로리터 전사 반응을 설정합니다. 이제 아크릴 유리 방패와 장갑을 착용. 사인 방사선 촬영에 대한 전사 반응에 알파-32P UTP의 5 마이크로리터 이하를 추가하여 방사능을 소개합니다.37°C에서 2시간 동안 마이크로센심심분리기 튜브에 반응 혼합물을 배양합니다. 젤 정제 RNA를 위해, 10%의 탈질 폴리아크라이알라미드 젤을 준비한다. 샘플을 젤 의 우물에 적재합니다.젤을 엑스레이 필름에 노출시키고 젤의 녹취록의 위치를 식별하고 젤 슬라이스를 잘라냅니다. 원심분리기 튜브에 젤 슬라이스를 넣고 균질화 팁으로 작은 조각으로 나뉩습니다. 단백질Ae K 버퍼를 추가하여 젤 조각을 담그게 합니다.실온에서 적어도 2 시간 동안 영양사에 튜브를 둡니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 고속 마이크로센심분리기에서 회전하여 젤 이물질을 제거하고 완충액을 회수합니다. 상류체, 소용돌이 및 원심분리기를 사용하여 동일한 양의 페놀 클로로폼을 튜브에 넣습니다.페놀 클로로폼으로 추출을 한 번 더 반복한 다음 클로로폼으로 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 단백질아제 K 완충제의 수성 상과 pH 5.2, 10 마이크로그램의 tRNA 또는 20 마이크로그램의 글리코겐, 영하 20도에 저장된 에탄올 2~3권으로 3마리의 아세테이트 3음절을 혼합한다. 튜브를 영하 80도에서 1시간 동안 그대로 둡니다.마이크로 센트심분리기에서 섭씨 4도에서 5~10분 동안 용액을 함유한 튜브를 회전시합니다. 상체를 조심스럽게 버리고 RNA 펠릿을 헹구기 위해 70%에탄올을 추가합니다. 2~5분간 회전합니다.에탄올을 조심스럽게 흡입하고 RNA 펠릿을 공기 건조시한다. 다음으로, RNA 펠릿을 용해시키기 위해 DEPC로 처리된 50마이크로리터의 물을 추가합니다. 샘플을 섭씨 영하 20도까지 보관하십시오.단백질과 RNA를 100마이크로리터의 반응부로 결합하려면, 먼저 pH 7.5에서 10밀리머 트리스 염화염을 50밀리머 칼륨, 1밀리몰라 DTT, 마이크로리터당 소 세럼 알부민, 마이크로리터 RNA 당 5단위, 마이크로리터 당 15마이크로그램, 마이크로리터 당 15마이크로그램, 15마이크로그램-마이크로리터-마이크로리터 tRNA, 1밀리아알라를 준비한다. 그런 다음 재조합 단백질 PTB 30 마이크로리터와 10 마이크로리터의 RNA를 적절한 풀에서 추가합니다. 섭씨 25도에서 약 30분 동안 체전 반응을 포함하는 튜브를 온도 블록에 놓습니다.다음으로, 4개의 선택 및 증폭을 통해 결합되지 않은 RNA로부터 결합된 RNA를 분수한다. 먼저, 진공 매니폴드에 부착된 니트로셀룰로오스 필터를 통해 실온에서 100마이크로리터 샘플을 필터링합니다. RNA 단백질 복합체는 필터에 남아 있습니다.멸균 면도날을 사용하면 필터를 조각으로 자르고 원심분리기 튜브에 삽입합니다. 필터 조각을 단백질Ae K 버퍼에 담그고 RNA를 복구하기 위해 최소 3시간 또는 하룻밤 동안 텀블러에 놓습니다. RNA 시료를 탈단백질화하려면 상온에서 5분 동안 페놀 클로로폼, 소용돌이 및 원심분리기의 동일한 양을 고속으로 첨가합니다.수성 상을 얻고 클로로폼으로 다시 추출하십시오. 그 후, pH 5.2및 절대 에탄올의 2~ 3권에서 3개의 어금다 나트륨 아세테이트의 1/10 부피와 상체를 혼합한다. 튜브를 영하 80도 의 냉동고에 30 분 동안 방치한 다음 원심 분리기를 10 분 동안 고속으로 둡니다.70%에탄올로 세척 및 건조 단계를 반복하고 DEPC 처리 된 물에서 RNA를 용해시합니다. 필터 바인딩 분석의 첫 번째 라운드 후, 세 라운드를 더 수행합니다. 다음으로, 단백질바운드 RNA 분획을 언바운드 분수로부터 분리하기 위해 두 차례의 전사, 결합 및 증폭을 수행한다.5배 TBE 버퍼에서 60대 1 아크릴아미드-비스 아크릴아미드 비율을 가진 네이티브 5% 폴리아크릴아미드 젤을 미리 캐스팅합니다. 그런 다음 RNA 단백질 결합 반응을 설정합니다. 젤을 섭씨 4도의 차가운 방에 5배 TBE 버퍼로 채워진 전기 전광 장치에 놓습니다.15분 동안 250볼트를 바르고 바인딩 반응을 다른 우물로 피펫합니다. 그런 다음 1~2시간 동안 250볼트에서 전기전도를 실행하여 결합되지 않은 RNA로부터 결합된 RNA를 더 분수합니다. 다음으로, 젤을 엑스레이 필름에 노출시키고, 사인방사선을 사용하여 결합된 RNA의 위치를 식별한다.결합된 RNA로 젤 슬라이스를 잘라 튜브에 삽입합니다. 젤 슬라이스를 분쇄하고 단백질Ae K 버퍼에서 3시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 이전에 설명한 바와 같이 페놀 클로로폼 및 클로로폼으로 추출을 반복합니다.용존 된 RNA로부터 cDNA를 합성합니다. 10x RT 버퍼 2개, AMV 역실사 2편, 역프라이머 1편, 물 5마이크로리터, 용존 RNA 10마이크로리터 등 20마이크로리터의 반응에 대비한다. 섭씨 42도에서 60분간 배양하세요.앞서 설명한 대로 20~25PCR 주기를 사용하여 cDNA를 증폭한다. RNA 합성, 단백질 결합 및 단백질 결합 및 결합되지 않은 분획의 분리 과정을 반복합니다. 단백질 결합을 분석하려면, 젤 이동성 이동 분석 또는 필터 결합 분석기를 사용하여 각 풀 내의 선택된 풀 또는 개별 서열에 대한 결합 친화성 및 특이성을 결정합니다.사인 방사선 촬영 또는 인광 탐지기를 사용하여 바운드 된 분수 및 바운드되지 않은 분획에서 밴드를 감지하고 정량화하십시오. 복제 및 시퀀스 정렬을 통해 프로토콜을 계속 합니다. 이 연구에서는 성공적인 선택 증폭을 달성했습니다.300배 더 높은 단백질 농도를 가진 포유류 폴리피리미딘-요로 결합 단백질은 풀 제로 서열에 거의 검출가능한 결합을 나타내지만 선택된 서열 풀에 대한 높은 친화력을 나타낸다. 선택 증폭은 선호하거나 합의 결합 부위를 가진 RNA 결합 단백질에 성공적으로 확인되었습니다. 상류 3-프라임 스플라이스 사이트에 결합하는 재조합 PTB의 첨가는 대안 또는 하류 3-프라임 스플라이스 사이트의 활성화로 이어집니다.대조적으로, 재조합 hnRNP C의 추가는 둘 다 3개의 프라임 스플라이스 사이트의 억압으로 이끌어 냅니다. 재조합 일반 접합 계수 U2AF65의 첨가는 hnRNP C-매개 3-프라임 스플라이스 사이트 억압을 반전시켰다. 각 바인딩 단계에서 높은 접이식 보강을 제공하는 좋은 무작위 라이브러리와 적절한 바인딩 조건이 성공을 위해 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.적절한 기능 적 검사 및 생체 내 테스트를 사용하여 이 방법의 결과를 검증할 수 있습니다. 유전자 발현 분야에서, 수많은 단백질의 기능은 이 기술을 사용하여 공부되었습니다. 폴리아크릴아미드 및 방사능으로 작업하는 동안 장갑과 방사성 씰을 보호하려면 보호해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...