Name: exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins at JoVE.com

Автор благодарит Национальные институты здравоохранения за прошедшее финансирование.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлено резюме ключевых шагов в процессе итеративного отбора (SELEX).
1. Генерация случайного шаблона библиотеки
<ol><li>Синтезировать переднюю грунтовку 5'- GTAATACGACTACTACTATAGGGTGATCAGATTCA GATTCTGATCTGATCA-3' и обратный грунт 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' путе?...

<ol>
	<li>Pribnow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+an+RNA+polymerase+binding+site+at+an+early+T7+promoter.">Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).</li><li>Breathnach, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+expression+of+eucaryotic+split+genes+coding+for+proteins.">Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).</li><li>Wickens, M., Stephenson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+conserved+AAUAAA+sequence:+four+AAUAAA+point+mutants+prevent+messenger+RNA+3'+end+formation.">Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation.</a> Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAcompete+methodology+and+application+to+determine+sequence+preferences+of+unconventional+RNA-binding+proteins.">RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins.</a> Methods. 118, 3-15 (2017).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+massively+parallel+SELEX+for+characterization+of+human+transcription+factor+binding+specificities.">Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities.</a> Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures.">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).</li><li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA.">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (1989).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+polypyrimidine+tract-binding+protein+is+necessary+for+spermatid+individualization.">Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).</li><li>Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+RNA+recognition+motif+3+of+U2+snRNA+auxiliary+factor+(U2AF(65))+is+essential+in+vivo+but+dispensable+for+activity+in+vitro.">The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro.</a> RNA. 10 (65), 240-253 (2004).</li><li>Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determinants+of+RNA-binding+specificity+of+the+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C+proteins.">The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins.</a> J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).</li><li>Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+Sex-lethal+antagonizes+the+splicing+factor+U2AF+to+regulate+alternative+splicing+of+transformer+pre-mRNA.">The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA.</a> Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).</li><li>Wilson, C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+fluorophore-specific+DNA+aptamer+with+weak+redox+activity.">Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.</a> Chemistry &amp; Biology. 5 (11), 609-617 (1998).</li><li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflections+of+a+Darwinian+Engineer.">Reflections of a Darwinian Engineer.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).</li><li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development.">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).</li><li>Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Bind-n-Seq:+quantitative+assessment+of+the+sequence+and+structural+binding+specificity+of+RNA+binding+proteins.">RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins.</a> Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).</li><li>Szeto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID-SELEX+for+RNA+aptamers.">RAPID-SELEX for RNA aptamers.</a> PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).</li><li>Rohloff, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Ligands+With+Protein-like+Side+Chains:+Modified+Aptamers+and+Their+Use+as+Diagnostic+and+Therapeutic+Agents.">Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).</li><li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+multiplexed+proteomic+technology+for+biomarker+discovery.">Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).</li><li>Zhuo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+SELEX+Technology+and+Aptamer+Applications+in+Biomedicine.">Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li><li>Blind, M., Blank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+Selection+Technology+and+Recent+Advances.+Molecular+Therapy.">Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy.</a> Nucleic Acids. 4, e223 (2015).</li><li>Jijakli, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+selection+world.">The in vitro selection world.</a> Methods. 106, 3-13 (2016).</li></ol>

Нуклеиновые кислотно-связывающие белки являются важными регуляторами развития животных и растений. Ключевым требованием для процедуры SELEX является разработка анализа, который может быть использован для разделения белковых и несвязанных рнковых фракций. В принципе, это анализ может б...

В клеточной биологии центральную роль играет регуляция генов. На одном или нескольких шагах вдоль пути экспрессии генов гены могут регулироваться. Эти шаги включают транскрипцию (инициация, удлинение и прекращение), а также сплайсинг, полиаденилацию или 3' конечную формацию, экспорт РНК, перевод мРНК и распад/локализацию первичных транскриптов. На этих этапах нуклеиновые кислотно-связывающие белки модулируют регуляцию генов. Определение связывающих участков для таких белков является важным аспектом изучения генного контроля. Мутационный анализ и сравнение филогенетической последовательности были использованы для обнаружения регулятивных последовательностей или белково-связывающих сайтов в нуклеиновых кислот, таких как промоутеры, сращивания сайтов, полиаденелизационных элементов, и трансляционные сигналы1, 2 , 3 , 4.
Предварительное сращивание является неотъемлемым шагом при экспрессии и регуляции генов. Большинство генов млекопитающих, в том числе у людей, имеют интроны. Большая часть этих транскриптов альтернативно сращиваются, производя несколько мРНК и белковых изоформ из одного и того же гена или первичного транскрипта. Эти изоформы имеют клеточную и развитую роль в клеточной биологии. 5' сращивания сайта, ветвь-точка, и полипиримидин тракта / 3 ' сращивания сайт критических сигналов сращивания, которые подлежат регулированию. В отрицательном регулировании, в противном случае сильное место сращивания репрессировано, тогда как в положительном регулировании в противном случае слабое место сращивания активировано. Сочетание этих событий производит множество функционально различных изоформ. РНК-связывающие белки играют ключевую роль в этих альтернативных событиях сращивания.
Многочисленные белки известны, чьи цели связывания (ы)или РНК-мишени остаются идентифицированными 5,6. Связывание регулятивных белков с их биологическими целями или последовательностями вниз по течению часто является сложным процессом. Для таких белков определение их целевой РНК или места связывания является важным шагом в определении их биологических функций. Как только место связывания идентифицировано, его можно дополнительно охарактеризовать с помощью стандартных молекулярных и биохимических анализов.
Описанный здесь подход имеет два преимущества. Во-первых, он может определить ранее неизвестный сайт связывания для белка, представляющих интерес. Во-вторых, дополнительным преимуществом этого подхода является то, что он одновременно позволяет мутагенеза насыщения, который в противном случае был бы трудоемким для получения сопоставимой информации о требованиях последовательности в пределах связывающего сайта. Таким образом, он предлагает более быстрый, простой и менее дорогостоящий инструмент для определения мест связывания белка в РНК. Первоначально этот подход (SELEX или систематическая эволюция лигандов eXponential обогащения) был использован для характеристики связывающего места для бактериофага T4 ДНК полимераза (ген 43 белка), который перекрывается с рибосомой связывания сайта в своей собственной мРНК. Обязательный сайт содержит 8-базовую последовательность цикла, представляющую 65 536 рандомизированных вариантов для анализа7. Во-вторых, этот подход также независимо использовался для того, чтобы показать, что из пула примерно 1013 последовательностейможновыбрать определенные места связывания или аптамеров для различных красителей. В самом деле, этот подход был широко используется во многих различных контекстах для выявления aptamers (РНК или последовательности ДНК) для связывания многочисленных лигандов, таких как белки, маленькие молекулы и клетки, и для катализа9. Например, аптамер может различать два производных ксантина, кофеин и теофиллин, которые отличаются наличием одной метиловой группы в кофеине10. Мы широко использовали этот подход (SELEX или итеративный отбор-усиление) для изучения того, как РНК-связывающие белки функционируют в сращивании или сращивании регулирования11, который будет основой для обсуждения ниже.
Случайная библиотека: Мы использовали случайную библиотеку из 31 нуклеотидов. Рассмотрение длины случайной библиотеки было слабо основано на идее, что общий коэффициент сращивания U2AF65 связывается с последовательностью между последовательностью ветвя- точек и 3' сращивания сайта. В среднем расстояние между этими сплайсинг-сигналами у метазоанов составляет от 20 до 40 нуклеотидов. Другой белок Секс-смертельный, как известно, связываются с плохо характеризуется нормативной последовательности вблизи 3' сращивания сайте своей цели до мРНК, трансформатор. Таким образом, мы выбрали случайную область из 31 нуклеотидов, в окружении грунтовых связывающих участков с местами ограничения фермента, чтобы обеспечить усиление ПЦР и крепление промоторизатора T7 РНК-полимераза для транскрипции in vitro. Теоретический размер или сложность библиотеки составили 431 или приблизительно 1018. Мы использовали небольшую часть этой библиотеки, чтобы подготовить наш случайный пул РНК (1012-1015) для экспериментов, описанных ниже.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant PTB</td>
			<td>Laboratory Preparation</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0277S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins

Регуляция генов играет важную роль во всех клетках. Транскрипционные, посттранскрипционные (или РНК обработки), переводные и пост-трансляционные шаги используются для регулирования конкретных генов. Последовательность конкретных нуклеиновых кислот-связывающих белков целевой конкретных последовательностей для контроля пространственной или временной экспрессии генов. Места связывания нуклеиновых кислот, как правило, характеризуются мутационным анализом. Тем не менее, многочисленные белки, представляющие интерес не имеют известного места связывания для такой характеристики. Здесь мы описываем подход к выявлению ранее неизвестных мест связывания РНК-связывающих белков. Она включает в себя итеративный отбор и усиление последовательностей, начиная с рандомизированного пула последовательности. После нескольких раундов этих шагов-транскрипции, связывания и усиления-обогащенных последовательностей секвенируются для определения предпочтительного места связывания (ы). Успех этого подхода контролируется с помощью анализов привязки in vitro. Впоследствии, in vitro и in vivo функциональные анализы могут быть использованы для оценки биологической значимости выбранных последовательностей. Этот подход позволяет идентифицировать и характеристики ранее неизвестного места связывания (ы) для любого РНК-связывающего белка, для которого существует анализ на отделение белковых и несвязанных РНК.

Следующие наблюдения демонстрируют успешное селекционное усиление (SELEX). Во-первых, мы проанализировали пул 0 и выбранные последовательности для привязки к белку, используемому для итеративного подхода к отбору-усилификации. На рисунке 2 показано, что ?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins at JoVE.com

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Изучение пространства последовательности для определения связывающих сайтов для регулятивных РНК-связывающих белков

Специфика последовательности имеет решающее значение для регуляции генов. Регуляторные белки, распознающие определенные последовательности, важны для регуляции генов. Определение функциональных связывающих участков для таких белков является сложной биологической проблемой. Итеративный подход к идентификации связывающего участка для РНК-связывающего белка описан здесь и применим ко всем БЕЛКАм-связывающим РНК.

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Протокол используется для насыщения мутагенезом белково-связывающего участка. Если ваш сайт связывания белков не известен, его можно определить с помощью этого протокола. Методика имеет отношение к диагностике и терапии заболеваний.Я считаю, что его полный потенциал в биомедицинских науках еще предстоит в полной мере использовать. Этот метод может быть широко применен к любому белку или реакции, где желаемые молекулы могут быть отделены от нежелательных молекул. Убедитесь, что библиотека правильно рандомизированы, и убедитесь, что во время каждого связывания и разделения шаг раза обогащения желаемых молекул высока.Она включает в себя несколько шагов и многие детали, которые лучше продемонстрировать, а не объяснить словами. После просмотра этого видео, вы должны быть комфортно с тем, как подготовить случайную библиотеку, синтезировать стартовый бассейн РНК, и выполнять связывающую реакцию на отдельные желаемые и нежелательные молекулы, чтобы получить высокое сродство и конкретные связующие. Во-первых, синтезировать перемотка вперед и обратной грунтовка путем химического синтеза на синтезаторе ДНК.Кроме того, синтезировать случайные библиотеки олигонуклеотид шаблон с 31 рандомизированных позиций. В ПЦР-трубке смешайте одномимолярный шаблон случайной библиотеки ДНК, одномимолярный вперед грунтовка, содержащая T7 РНК полимеразы промоутер и обратной грунтовки, 20-миллимолярный Трис на рН восемь, 1,5-миллимолярный хлорид магния магния, 50-миллимолярный хлорид калия, 1-микрограмм на миллилитр ацетилированного бычьего сыворотки альбумин, две единицы Taq полимеразы, и 200 микрограммов на миллилитр ацетилированного бычьего сыворотки альбумин, две единицы Taq полимеразы, и 200 микрограмм каждый из dNTPs. Настройка машины PCR с пятью циклами денатурации, annealing, и расширение шаги, а затем один цикл расширения, чтобы прикрепить промоутер к библиотеке ДНК.Настройка 100-микролитровой транскрипционной реакции, содержащей буфер транскрипции T7, одномимолярную случайную ДНК пула библиотек, пятимилимолярный DTT, двухмилимолярный GTP, по одному миллимолару АТФ, CTP и UTP, а также полимеразу T7 T7 с двумя единицами на микролитр. Теперь на надеть акриловый стеклянный щит и перчатки. Введи радиоактивность, добавив 5 микролитров или меньше альфа-32P UTP в транскрипционной реакции для ауторадиографии.Инкубировать реакционной смеси в микроцентрифуг трубки в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию. Для гель-очистки РНК, подготовить 10%денатурации полиакриламинид гель. Загрузите образцы в колодцы геля.Выставить гель на рентгеновской пленке, и определить расположение стенограммы на гель и вырезать гель ломтик. Поместите гель ломтик в центрифугу трубки и разбить на более мелкие кусочки с гомогенизатором отзыв. Добавьте буфер протеиназы K, чтобы погрузить кусочки геля.Оставьте трубку на гайки, по крайней мере два часа при комнатной температуре. Затем вращайся в высокоскоростном микроцентрифуге в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы удалить гель мусора и восстановить буферный раствор. Добавьте равный объем фенола-хлороформа в трубку с супернатантом, вихрем и центрифугой.Повторите экстракции с фенол-хлороформ еще раз, а затем с хлороформом еще раз. Затем смешайте аквеозную фазу буфера протеиназы K с 1/10 объемом трехмязыкного ацетата натрия при рН 5,2, 10 микрограммах тРНК или 20 микрограммах гликогена и от двух до трех томов этанола, хранящихся при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Оставьте трубку при температуре минус 80 градусов по Цельсию на один час.Закрути трубку, содержащую раствор в течение пяти-десяти минут при четырех градусах Цельсия в микроцентрифуге. Отбросьте супернатант тщательно, и добавить 70% этанола для полоскания гранул РНК. Спин в течение двух-пяти минут.Аспирировать этанол тщательно, и воздух сухой РНК гранулы. Затем добавьте 50 микролитров воды, обработанных DEPC, чтобы solubilize гранулы РНК. Оставьте образец при температуре минус 20 градусов по Цельсию для хранения.Для связывания белка и РНК в объеме реакции 100 микролитров, сначала подготовить 10-миллимолярный гидрохлорид Tris при рН 7.5, содержащий 50-миллимолярный хлорид калия, одномимиловый DTT, 09-микрограмм на микролитр бычьего альбумин сыворотки, 5 единиц на микролитр РНК, 15-микрограмм-на-микролитр тРНК, и один миллимолярный EDTA. Затем добавьте 30 микролитров рекомбинантного белка ПТБ и 10 микролитров РНК из соответствующего бассейна. Поместите трубки, содержащие связывающие реакции, в температурный блок в течение примерно 30 минут при температуре 25 градусов по Цельсию.Далее, дробировать связанную РНК от несвехой РНК через четыре раунда отбора и усиления. Во-первых, фильтровать 100-микролитер образца при комнатной температуре через нитроцеллюлозы фильтр прилагается к вакуумной многообразия. На фильтре остается РНК-белковый комплекс.Стерильным лезвием бритвы нарежьте фильтр на фрагменты и вставьте его в центрифугу. Погрузите кусочки фильтра в буфер протеиназы K и поместите их на стакан минимум на три часа или на ночь, чтобы восстановить РНК. Чтобы депротеинизировать образец РНК, добавьте равный объем фенол-хлороформа, вихря, а затем центрифуги на высокой скорости в течение пяти минут при комнатной температуре.Получить aqueous фазы, и экстракт с хлороформом снова. После этого смешайте супернатант с 1/10 объемом трехмолярного ацетата натрия при рН 5,2 и двух-трех томах абсолютного этанола. Оставьте трубку в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию на 30 минут, а затем центрифуга на высокой скорости в течение 10 минут.Повторите стирки и сушки шаги с 70% этанола, и solubilize РНК в DEPC-обработанной воды. После первого раунда анализа связывания фильтра проведем еще три раунда. Далее выполните два раунда транскрипции, связывания и усиления, чтобы отделить фракции РНК, связанные с белком, от несвязанные фракции.Precast родной 5%полиакриламид гель с 60-к-одному акриламид-бис-акриламид соотношение в 5x TBE буфера. Затем навеять реакцию связывания РНК-белка. Поместите гель в электрофорезное устройство, наполненное 5x буфером TBE, в холодную комнату при четырех градусах Цельсия.Нанесите 250 вольт в течение 15 минут, и пипетка связывающей реакции в различных скважинах. Затем далее дробить связанную РНК от несвежим РНК, запуская электрофорез на 250 вольт в течение одного-двух часов. Затем подвергайте гель рентгеновской пленке и определите местоположение связанной РНК с помощью ауторадиографии.Вырежьте ломтик геля с связанной РНК, и вставьте его в трубку. Измельчите ломтик геля и инкубировать в буфере протеиназы K в течение трех часов или на ночь. Повторите экстракции с фенол-хлороформ и хлороформ, как описано ранее.Синтезировать кДНА из растворенного РНК. Подготовь 20 микролитров реакции, в том числе два микролитера буфера 10x RT, два микролитров обратной транскриптазы AMV, один микролитр обратной грунтовки, пять микролитров воды и 10 микролитров растворенного РНК. Инкубировать при 42 градусах по Цельсию в течение 60 минут.Увеличь cDNA, используя от 20 до 25 циклов ПЦР, как описано ранее. Повторите процесс синтеза РНК, связывания белков и разделения белковых и несвязанные фракции. Для анализа связывания белков используйте анализ смены подвижности геля или анализ связывания фильтров для определения связывающей близости и специфичности выбранных бассейнов или отдельных последовательностей в каждом бассейне.Используйте авторадиографию или фосфорный образец для обнаружения и количественной оценки полос в связанной фракции и несвежаемой фракции. Продолжить протокол с клонированием и выравниванием последовательности. В этом исследовании был достигнут успешный отбор-усиление.Полипиримидиновый связывающий белок млекопитающих с 300-кратной более высокой концентрацией белка показывает едва обнаруживаемую привязку к нулевой последовательности бассейна, но высокое сродство к выбранному бассейну последовательности. Отбор-усиление успешно определены на РНК-связывающих белков с предпочтительным или консенсус обязательным сайтом. Добавление рекомбинантного ПТБ, который связывается с вверх по течению три премьер сращивания сайта, приводит к активации альтернативного или вниз по течению три премьер сращивания сайта.В отличие от этого, добавление рекомбинантных hnRNP C приводит к репрессиям обоих трех-премьер сращивания сайтов. Добавление рекомбинантных общего фактора сращивания U2AF65 обратил вспять hnRNP C-опосредовано три премьер сращивания сайте репрессии. Важно помнить, что хорошая рандомизированная библиотека и надлежащие условия связывания, которые дают высокое обогащение складок на каждом шагу связывания, необходимы для успеха.Для проверки результатов такого подхода можно использовать соответствующие функциональные анализы и тесты in vivo. В области экспрессии генов, функции многочисленных белков были изучены с помощью этой техники. При работе с полиакриламиндом и радиоактивной печатью для защиты важно использовать перчатки и радиоактивное уплотнение.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Метил-связывающий захват Секвенирование ДНК для ТКАНЕЙ Patient

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Novel Выделение РНК-связывающих белков Стремительное Методология

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

При содействии формальдегида изоляции нормативных элементов для измерения доступности хроматина в клетках млекопитающих

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Роман насыщения мутагенеза подхода: Один шаг характеристика регламентационный протеин привязки сайтов в РНК с помощью кислота

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...