Name: exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins at JoVE.com

Yazar, geçmiş fon için Ulusal Sağlık Enstitüleri teşekkür eder.

NOT: Şekil 1 yinelemeli seçim-amplifikasyon (SELEX) sürecindeki önemli adımların bir özetini sağlar.
1. Rasgele kitaplık şablonu oluşturma
<ol><li>İleri astar 5'- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' ve ters astar 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' bir DNA sentezleyicisi üzerinde kimyasal sentez ile sentezleyin. NOT: Astarlar ve rasgele kitaplık ticari olarak sentezlenebilir.</li>
	<li>Synthesize rasgele kütüphane oligonükleotid şa...

<ol>
	<li>Pribnow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+an+RNA+polymerase+binding+site+at+an+early+T7+promoter.">Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).</li><li>Breathnach, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+expression+of+eucaryotic+split+genes+coding+for+proteins.">Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).</li><li>Wickens, M., Stephenson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+conserved+AAUAAA+sequence:+four+AAUAAA+point+mutants+prevent+messenger+RNA+3'+end+formation.">Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation.</a> Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li><li>Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAcompete+methodology+and+application+to+determine+sequence+preferences+of+unconventional+RNA-binding+proteins.">RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins.</a> Methods. 118, 3-15 (2017).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+massively+parallel+SELEX+for+characterization+of+human+transcription+factor+binding+specificities.">Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities.</a> Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures.">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).</li><li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA.">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (1989).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+polypyrimidine+tract-binding+protein+is+necessary+for+spermatid+individualization.">Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).</li><li>Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+RNA+recognition+motif+3+of+U2+snRNA+auxiliary+factor+(U2AF(65))+is+essential+in+vivo+but+dispensable+for+activity+in+vitro.">The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro.</a> RNA. 10 (65), 240-253 (2004).</li><li>Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determinants+of+RNA-binding+specificity+of+the+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C+proteins.">The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins.</a> J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).</li><li>Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+Sex-lethal+antagonizes+the+splicing+factor+U2AF+to+regulate+alternative+splicing+of+transformer+pre-mRNA.">The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA.</a> Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).</li><li>Wilson, C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+fluorophore-specific+DNA+aptamer+with+weak+redox+activity.">Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.</a> Chemistry &amp; Biology. 5 (11), 609-617 (1998).</li><li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflections+of+a+Darwinian+Engineer.">Reflections of a Darwinian Engineer.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).</li><li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development.">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).</li><li>Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Bind-n-Seq:+quantitative+assessment+of+the+sequence+and+structural+binding+specificity+of+RNA+binding+proteins.">RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins.</a> Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).</li><li>Szeto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAPID-SELEX+for+RNA+aptamers.">RAPID-SELEX for RNA aptamers.</a> PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).</li><li>Rohloff, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Ligands+With+Protein-like+Side+Chains:+Modified+Aptamers+and+Their+Use+as+Diagnostic+and+Therapeutic+Agents.">Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).</li><li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-based+multiplexed+proteomic+technology+for+biomarker+discovery.">Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).</li><li>Zhuo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+SELEX+Technology+and+Aptamer+Applications+in+Biomedicine.">Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li><li>Blind, M., Blank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+Selection+Technology+and+Recent+Advances.+Molecular+Therapy.">Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy.</a> Nucleic Acids. 4, e223 (2015).</li><li>Jijakli, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+selection+world.">The in vitro selection world.</a> Methods. 106, 3-13 (2016).</li></ol>

Nükleik asit bağlayıcı proteinler hayvan ve bitki gelişiminin önemli düzenleyicileridir. SELEX prosedürü için önemli bir gereklilik protein bağlı ve bağlı olmayan RNA fraksiyonları ayırmak için kullanılabilecek bir titregeliştirilmesidir. Prensip olarak, bu töz filtre bağlayıcı tayoz, jel hareketlilik kayması tsay veya rekombinant proteinler, saflaştırılmış proteinler veya protein kompleksleri için bir matris bağlayıcı tsay19 gibi bir in vitro bağlayıcı tsay ol...

Hücre biyolojisinde gen regülasyonu merkezi bir rol oynar. Gen ekspresyonu yolu boyunca bir veya birden fazla adımda genler düzenlenme potansiyeline sahiptir. Bu adımlar transkripsiyon (başlatma, uzama ve sonlandırma) yanı sıra birleştirme, poliadenilasyon veya 3' bitiş oluşumu, RNA ihracat, mRNA çeviri ve birincil transkript çürüme / lokalizasyon içerir. Bu adımlarda, nükleik asit bağlayıcı proteinler gen regülasyonlarını modüle eder. Bu tür proteinler için bağlayıcı alanların belirlenmesi gen kontrolü eğitiminin önemli bir yönüdür. Mutasyonel analiz ve filogenetik dizi karşılaştırması, promotörler, splice siteleri, poliadenilasyon elemanları ve çeviri sinyalleri 1 gibi nükleik asitlerdeki düzenleyici dizileri veya protein bağlayıcı alanları keşfetmek için kullanılmıştır1, 2.000 , 3.2.2 , 4 .
Pre-mRNA birleştirme gen ekspresyonu ve regülasyonu sırasında ayrılmaz bir adımdır. Memeli genlerinin çoğunda, insanlarda da dahil olmak üzere, intronlar vardır. Bu transkriptlerin büyük bir kısmı alternatif olarak birleştirilmiş olup, aynı gen veya primer transkriptten birden fazla mRNA ve protein isoformları üretilir. Bu isoformların hücre biyolojisinde hücreye özgü ve gelişimsel rolleri bulunur. 5' splice sitesi, şube noktası ve polipirimidin-yolu/3' splice sitesi, yönetmeliğe tabi kritik birleştirme sinyalleridir. Olumsuz düzenlemede, başka bir şekilde güçlü bir splice sitesi bastırılır, olumlu düzenlemede ise zayıf bir splice sitesi etkinleştirilir. Bu olayların bir kombinasyonu işlevsel olarak farklı isoforms bir bolluk üretir. RNA bağlayıcı proteinler bu alternatif birleştirme olaylarında kilit rol oynarlar.
Çok sayıda protein olan bağlayıcı site (ler) veya RNA hedefleri5,6tespit edilecektir bilinmektedir. Düzenleyici proteinleri aşağı biyolojik hedeflerine veya dizilerine bağlamak genellikle karmaşık bir süreçtir. Bu tür proteinler için, hedef RNA veya bağlayıcı sitenin belirlenmesi biyolojik fonksiyonlarını tanımlamada önemli bir adımdır. Bağlayıcı bir bölge tanımlandıktan sonra, standart moleküler ve biyokimyasal analizler kullanılarak daha da karakterize edilebilir.
Burada açıklanan yaklaşımın iki avantajı vardır. İlk olarak, ilgi bir protein için daha önce bilinmeyen bir bağlayıcı site belirleyebilirsiniz. İkinci olarak, bu yaklaşımın bir avantajı da aynı anda doygunluk mutagenezi sağlar, aksi takdirde ciltleme site içinde dizi gereksinimleri hakkında karşılaştırılabilir bilgi elde etmek için emek yoğun olacaktır. Böylece, RNA protein bağlayıcı siteleri tanımlamak için daha hızlı, daha kolay ve daha az maliyetli bir araç sunuyor. Başlangıçta, bu yaklaşım (EXponential zenginleştirme ile Ligands Sistematik Evrimi) bakteriyofaj T4 DNA polimeraz (gen 43 protein), kendi mRNA ribozom bağlayıcı site ile örtüşen bağlayıcı site için bağlayıcı site karakterize etmek için kullanılmıştır. Bağlama sitesi,analiz7 için 65.536 randomize varyantı temsil eden 8-baz döngü dizisi içerir. İkinci olarak, yaklaşım da bağımsız olarak farklı boyalar için belirli bağlama siteleri veya aptamers yaklaşık 1013 dizileri8bir havuzdan seçilebilir göstermek için kullanılmıştır. Aslında, bu yaklaşım geniş birçok farklı bağlamlarda aptamers tanımlamak için kullanılmıştır (RNA veya DNA dizileri) proteinler gibi çok sayıda ligands bağlamak için, küçük moleküller, ve hücreler, ve kataliz için9. Örnek olarak, bir aptamer kafein 10 bir metil grubunun varlığı ile farklı iki ksantin türevleri,kafein ve teofilin arasında ayrım yapabilirsiniz. Bu yaklaşımı (SELEX veya yinelemeli seçilim-amplifikasyon) aşağıdaki tartışmanın temelini oluşturacak olan RNA bağlayıcıproteinlerin 11'i birleştirme veya birleştirme düzenlemesinde nasıl işlediğini incelemek için yoğun olarak kullandık.
Rasgele kütüphane: Biz 31 nükleotit rasgele bir kütüphane kullanılır. Rasgele kitaplık için uzunluk dikkate gevşek genel birleştirme faktörü U2AF65 dal noktası sırası ve 3 'splice site arasında bir dizi bağlanır fikrine dayanıyordu. Ortalama olarak, metazoanlarda bu birleştirme sinyalleri arasındaki boşluk 20 ila 40 nükleotit aralığındadır. Başka bir protein Sex-lethal hedef öncesi mRNA, transformatör3 'splice site yakınında kötü karakterize düzenleyici dizi bağlamak için biliniyordu . Böylece, PCR amplifikasyonu ve in vitro transkripsiyon için T7 RNA polimeraz organizatörü ek için izin vermek için restriksiyon enzim siteleri ile astar bağlama siteleri ile çevrili 31 nükleotit, rasgele bir bölge seçti. Teorik kütüphane boyutu veya karmaşıklığı 431 veya yaklaşık 1018idi. Biz aşağıda açıklanan deneyler için rasgele RNA havuzu (~ 1012-1015)hazırlamak için bu kütüphanenin küçük bir kısmını kullandı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant PTB</td>
			<td>Laboratory Preparation</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0277S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring sequence space to identify binding sites for regulatory rna-binding proteins

Gen regülasyonu tüm hücrelerde önemli bir rol oynar. Transkripsiyonel, transkripsiyon sonrası (veya RNA işleme), çevirive çeviri sonrası adımlar belirli genleri düzenlemek için kullanılır. Diziye özgü nükleik asit bağlayıcı proteinler, mekansal veya zamansal gen ekspresyonunu kontrol etmek için belirli dizileri hedef ler. Nükleik asitlerdeki bağlanma alanları tipik olarak mutasyonel analiz ile karakterizedir. Ancak, ilgi çok sayıda protein bu tür karakterizasyon için bilinen bir bağlayıcı site var. Burada RNA bağlayıcı proteinler için daha önce bilinmeyen bağlayıcı siteleri tanımlamak için bir yaklaşım açıklar. Randomize sıralı bir havuzla başlayan dizilerin yinelemeli seçimi ve amplifikasyonunu içerir. Bu adım-transkripsiyon, bağlama ve amplifikasyon-zenginleştirilmiş dizileri birkaç tur sonra tercih edilen bir bağlama site (ler) tanımlamak için sıralanır. Bu yaklaşımın başarısı in vitro bağlayıcı tahliller kullanılarak izlenir. Daha sonra, in vitro ve in vivo fonksiyonel tahliller seçilen dizilerin biyolojik alaka değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, proteine bağlı ve bağlı olmayan RNA'ları ayırmak için bir tizin bulunduğu herhangi bir RNA bağlayıcı protein için önceden bilinmeyen bir bağlayıcı sitenin(ler) tanımlanmasını ve karakterizasyonuna olanak tanır.

Aşağıdaki gözlemler başarılı seçim-amplifikasyon (SELEX) göstermektedir. İlk olarak, tekrarlayıcı seçilim-amplifikasyon yaklaşımı için kullanılan proteine bağlanmak için havuz 0 ve seçilen dizileri analiz ettik. Şekil 2, memeli polipirimidin yolu bağlayıcı proteininin (PTB) havuz 0 dizisine zar zor saptanabilir bir bağlanma gösterdiğini, ancak seçilen dizi havuzuna olan yakınlığın yüksek olduğunu göstermektedir. Seçilen ha...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins at JoVE.com

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Protokol, protein bağlayıcı bir alanın doygunluk mutagenezi için kullanılır. Protein bağlayıcı siteniz bilinmiyorsa, bu protokol kullanılarak tanımlanabilir. Bu tekniğin hastalık tanı ve tedavisi ile önemi vardır.Biyomedikal bilimlerdeki tüm potansiyelinin tamamen sömürülmeye devam ettiğine inanıyorum. Bu yöntem, istenilen moleküllerin istenmeyen moleküllerden ayrılabildiği herhangi bir protein veya reaksiyona geniş ölçüde uygulanabilir. Kitaplığın düzgün bir şekilde randomize olduğundan emin olun ve her bağlama ve ayırma adımı sırasında istenilen moleküllerin kat zenginleştirme yüksek olduğundan emin olun.Kelimelerle açıklansa daha iyi gösterilen birkaç adım ve birçok ayrıntı içerir. Bu videoyu izledikten sonra, rasgele bir kitaplık hazırlamak, bir başlangıç RNA havuzu sentezlemek ve yüksek yakınlık ve özel bağlayıcılar elde etmek için ayrı istenen ve istenmeyen molekülleriçin bağlayıcı bir reaksiyon gerçekleştirmek nasıl rahat olmalıdır. İlk olarak, bir DNA sentezleyici üzerinde kimyasal sentez ile ileri astar ve ters astar sentez.Ayrıca, 31 randomize pozisyonlar ile rasgele bir kütüphane oligonükleotid şablonu sentezleyin. Bir PCR tüpünde, tek mikromolar DNA rastgele kitaplık şablonu karıştırın, T7 RNA polimeraz promotörü ve ters astar içeren tek mikromolar ileri astar, pH sekizde 20 milimolar Tris, 1.5 milimolar magnezyum klorür, 50 milimolar potasyum klorür, 1 mikrogram-mililitre asetit esetit li sığır serum albumini, iki adet Takka polimeraz ve 200 mikromolar dNTP'ler. PCR makinesini beş döngü denatürasyon, annealing ve uzatma adımlarıyla ayarlayın ve ardından organizatörü DNA kitaplığına takmak için bir uzatma döngüsü izleyin.T7 transkripsiyon tamponu, tek mikromolar rastgele kütüphane havuzu DNA, beş milimolar DTT, iki milimolar GTP, ATP, CTP ve UTP'nin her biri bir milimolar ve mikrolitre başına iki adet T7 RNA polimeraz içeren 100 mikrolitrelik transkripsiyon reaksiyonu ayarlayın. Şimdi akrilik cam kalkan ve eldiven takın. Otoradyografi için transkripsiyon reaksiyonuna 5 mikrolitre veya daha az alfa-32P UTP ekleyerek radyoaktiviteyi tanıyın.Reaksiyon karışımını mikrosentrifuge tüpünde 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. RNA'yı jel-arındırmak için %10 denaturing poliakrilamid jeli hazırlayın. Numuneleri jelkuyularına yükleyin.Bir x-ray filmi jel maruz ve jel üzerinde transkript yerini belirlemek ve jel dilim kesip. Bir santrifüj tüp jel dilim yerleştirin ve bir homogenizer ucu ile daha küçük parçalara bölün. Jel parçaları batırmak için proteinaz K tampon ekleyin.Oda sıcaklığında en az iki saat boyunca bir nutator üzerinde tüp bırakın. Sonra jel enkaz kaldırmak ve tampon çözeltisi kurtarmak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca yüksek hızlı bir mikrosantrifüj spin. Supernatant, girdap ve santrifüj ile tüp içine fenol-kloroform eşit hacimli ekleyin.Ekstraksiyonu fenol-kloroform ile bir kez daha tekrarlayın ve sonra bir kez daha kloroform ile. Daha sonra, proteinaz K tamponunun sulu fazını pH 5.2'de üç molar sodyum asetat 1/10 hacmi, 10 mikrogram tRNA veya 20 mikrogram glikojen ve eksi 20 santigrat derecede depolanan 2-3 cilt etanol ile karıştırın. Tüpü eksi 80 derecede bir saat bekletin.Çözeltiyi içeren tüpü mikrosantrifüjde dört santigrat derecede beş ila 10 dakika döndürün. Supernatant dikkatle atın ve RNA pelet durulamak için% 70 etanol ekleyin. 2-5 dakika dön.Etanol'ü dikkatlice aspire edin ve RNA peletini havayla kurutun. Daha sonra, RNA peletini solubilize etmek için DEPC ile arıtılmış 50 mikrolitre su ekleyin. Numuneyi depoiçin eksi 20 derecede bırakın.Protein ve RNA'yı 100 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmine bağlamak için, ilk 50-milimolar potasyum klorür içeren pH 7.5 10-milimolar Tris hidroklorür hazırlamak, bir milimolar DTT, 09-mikrogram-başına mikrolitre sığır serum albumin, 5-adet-başına mikrolitre RNain, 15-mikrogram-başına mikrolitre tRNA, ve bir mili-milli milimomolar EDTA içeren. Daha sonra uygun havuzdan 30 mikrolitre rekombinant protein PTB ve 10 mikrolitre RNA ekleyin. Bağlayıcı reaksiyonları içeren tüpleri 25 santigrat derecede yaklaşık 30 dakika boyunca bir sıcaklık bloğuna yerleştirin.Ardından, bağlı RNA'yı bağlı RNA'yı dört tur seçim ve amplifikasyon ile kesirleyin. İlk olarak, oda sıcaklığındaki 100 mikrolitrelik numuneyi vakum manifolduna bağlı bir nitroselüloz filtreden filtreleyin. RNA-protein kompleksi filtrede kalır.Steril bir jiletle filtreyi parçalara ayırın ve bunları bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Filtre parçalarını proteinaz K tamponuna batırın ve RNA'yı kurtarmak için en az üç saat veya bir gece boyunca bir bardak üzerine yerleştirin. RNA örneğini deproteinize etmek için, eşit hacimde fenol-kloroform, girdap ve oda sıcaklığında beş dakika yüksek hızda santrifüj ekleyin.Sulu faz elde ve kloroform ile tekrar ayıklayın. Bundan sonra, pH 5.2 ve mutlak etanol iki ila üç hacimli üç molar sodyum asetat 1/10 hacmi ile supernatant karıştırın. Tüpü eksi 80 derecelik bir dondurucuda 30 dakika bekletin ve sonra 10 dakika yüksek hızda santrifüj edin.Yıkama ve kurutma adımlarını %70 etanol ile tekrarlayın ve RNA'yı DEPC ile işlenmiş suda çözün. Filtre bağlama teşbinci ilk turdan sonra, üç tur daha gerçekleştirin. Daha sonra, proteine bağlı RNA fraksiyonlarını bağlanmamış fraksiyonlardan ayırmak için iki tur transkripsiyon, bağlama ve amplifikasyon gerçekleştirin.Precast 5x TBE tampon 60-bir akrilamid-bis-akrilamid oranı ile yerli% 5 poliakrilamid jel. Sonra RNA-protein bağlama reaksiyonu ayarlayın. Jeli, 5x TBE tamponu yla dolu bir elektroforez cihazına, 4 derece lik soğuk bir odada yerleştirin.15 dakika boyunca 250 volt uygulayın ve pipet farklı kuyulara bağlama reaksiyonu. Daha sonra bağlı RNA'yı bağlı RNA'dan 250 voltta 1-2 saat çalıştırarak kesirlendirin. Daha sonra, bir x-Ray filmi jel maruz ve otoradyografi kullanarak bağlı RNA yerini belirlemek.Bağlı RNA ile jel dilim kesip ve bir tüp içine takın. Jel dilimini ezin ve proteinaz K tamponuna üç saat veya bir gecede inkübedin. Daha önce açıklandığı gibi fenol-kloroform ve kloroform ile ekstraksiyon tekrarlayın.Çözünmüş RNA'dan cDNA sentezle. İki mikrolitre 10x RT tamponu, iki mikrolitre AMV ters transkriptaz, bir mikrolitre ters astar, beş mikrolitre su ve çözünmüş RNA'nın 10 mikrolitresi dahil olmak üzere 20 mikrolitre reaksiyon hazırlayın. 42 derecede 60 dakika kuluçkaya yat.Daha önce açıklandığı gibi 20 ila 25 PCR döngüleri kullanarak cDNA'yı yükseltin. RNA sentezi, protein bağlanması ve proteine bağlı ve bağlanmamış fraksiyonların ayrılması işlemini tekrarlayın. Protein bağlamaanaliz etmek için, her havuz içinde seçilen havuzları veya bireysel dizileri için bağlayıcı yakınlık ve özgüllük belirlemek için jel hareketlilik kayması analizi veya filtre bağlayıcı tsay kullanın.Bağlı kesir ve bağlı olmayan fraksiyondaki bantları tespit etmek ve ölçmek için otoradyografografi veya fosfor görüntüleyici kullanın. Klonlama ve sıra hizalama ile protokolü devam edin. Bu çalışmada başarılı bir seçim-amplifikasyon sağlanmıştır.300 kat daha yüksek protein konsantrasyonuna sahip memeli polipirimidin yolu bağlayıcı protein, havuz sıfır dizisine zar zor bağlanabildiğini ancak seçilen dizi havuzuna olan yakınlığı gösterir. RNA bağlayıcı proteinlerde tercih edilen veya konsensus bağlayıcı alana sahip seçici-amplifikasyon başarıyla saptanmadı. Rekombinant PTB eklenmesi, hangi bir upstream üç-prime splice siteye bağlanır, alternatif veya downstream üç-prime splice sitenin aktivasyonu yol açar.Buna karşılık, rekombinant hnRNP C eklenmesi her iki üç asal splice sitelerin inbastırılmasına yol açar. Rekombinant genel birleştirme faktörü U2AF65 eklenmesi hnRNP C aracılı üç asal splice site baskı ters. Bu iyi bir randomize kütüphane ve her bağlayıcı adımda yüksek kat zenginleştirme vermek uygun bağlama koşulları başarı için gerekli olduğunu hatırlamak önemlidir.Bu yaklaşımın sonucunu doğrulamak için uygun fonksiyonel tahliller ve in vivo testler kullanılabilir. Gen ekspresyonu alanında bu teknik kullanılarak çok sayıda proteinin işlevleri incelenmiştir. Poliakrilamid ve radyoaktivite ile çalışırken koruma için eldiven ve radyoaktif sızdırmazlık kullanmak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...