Name: in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00
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La Dra. Sylvie Morgeaux y la Dra. Jean-Michel Chapsal deben ser reconocidas por su participación clave para establecer el ensayo ELISA sobre lotes de vacunas y para organizar talleres internacionales y estudios colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali por la lectura crítica del manuscrito. El Dr. Pierre Perrin fue responsable del aislamiento y caracterización de mAb-D1. Este trabajo ha sido apoyado principalmente por la financiación del Instituto Pasteur.

1. Precauciones de seguridad
NOTA: Este método es aplicable tanto a rabV vivo como a la vacuna inactivada.
<ol><li>Utilice buenos procedimientos de práctica de laboratorio y seguridad.</li>
	<li>Use el equipo de protección personal (PPE) adecuado, incluyendo abrigo desechable, guantes, máscara, gafas, etc.</li>
	<li>Cuando el virus vivo esté valorado, utilice un armario de seguridad biológica de clase II.<ol>
<li>Considere cualquier material en contacto con las muestras (reactivos, sol...

El epítopo reconocido por el mAb-D1 se encuentra en el sitio antigénico III de la glicoproteína RABV, que no sólo es inmunodominante para la inducción de VNAbs, sino que también participa en neurovirulencia, patogenicidad40,,41 y reconocimiento de receptores42. Hay otro sitio antigénico importante a lo largo de la glicoproteína, sitio II43, contra el cual se han aislado varios MAbs como mAb-WI-1112<sup class...

Desde hace más de 50 años, la prueba1 de NIH se utiliza como método estándar de oro para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia antes de la liberación por lotes. Esta prueba consiste en una inmunización intraperitoneal de grupos de ratones con la vacuna que se va a probar seguida de un desafío intracerebral (IC) 14 días después con la cepa del virus Challenge (CVS) del virus de la rabia (RABV). La potencia se evalúa a partir de la proporción de ratones que sobreviven al desafío IC. Aunque la OMS2 y la Farmacopea Europea3 todavía requieren la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna, esta prueba sufre varios obstáculos: los resultados son muy variables4; RABV infeccioso se utiliza durante el desafío y esto requiere tanto la habilidad técnica como estrictas medidas de bioseguridad; se utilizan un gran número de animales, y la gravedad del desafío plantea serias preocupaciones éticas5. Se ha desarrollado una variación menos grave de esta prueba: dos semanas después de la inmunización intraperitoneal, los ratones no son desafiados por IC, sino que se desangran y se analizan para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes RABV específicos (VNAbs) en su suero mediante una prueba de neutralización in vitro. Sin embargo, esta prueba todavía requiere sacrificar un gran número de ratones de laboratorio, aunque ya está en uso para las vacunas veterinarias6,7 y se ha considerado para vacunas humanas8.
A partir de ahora, tanto las recomendacionesInternacionales 9 como las10 Europeas alientan a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (Laboratorios Oficiales de Control de Medicina - Omcl) a implementar la estrategia de reemplazo, reducción y refinamiento de pruebas en animales de laboratorio, denominada estrategia 3R. La Directiva Europea 2010/63/UE (en vigor desde 2013/01/01) relativa a la protección y el bienestar de los animales también ha reforzado las limitaciones para los fabricantes de vacunas y los laboratorios que participan en el control de calidad de las vacunas contra la rabia, así como en la investigación de la rabia11. Como resultado, el desarrollo, la validación y el uso de enfoques in vitro alternativos se han convertido en una prioridad. Estos no sólo son éticamente sólidos, sino que también pueden reducir los costos de pruebas por lotes y acortar el tiempo para los resultados a horas en lugar de semanas3.
En la superficie de la partícula RABV, la glicoproteína adopta una forma trimrica12,13,14,15,16. En la vacuna antirrábica, esta forma trimérica nativa constituye el principal vNAbs inductor de inmunogenes17, mientras que las glicoproteínas monoméricas, solubles o desnaturalizadas son poco inmunogénicas18,19. Por lo tanto, la preservación de los recortadores de la glicoproteína a lo largo del proceso de producción de la vacuna es un buen indicador para la preservación de un potencial inmunogénico óptimo. Varios métodos inmunoquímicos, como la prueba de unión de anticuerpos20,21, la prueba22 de inmunodifusión radial única y la prueba ELISA23,24,25,26,27 son recomendados por la serie2 de informes técnicos de la OMS y la monografía europea3 para cuantificar el contenido de antígeno según las vacunas contra la rabia. Estos son utilizados por los fabricantes para monitorear la consistencia de la producción de vacunas y por la OMCL para evaluar la formulación consistente de lotes de vacunas humanas28,, incluso si la prueba de NIH todavía se considera para la potencia.
Sin embargo, todos estos métodos inmunoquímicos no son equivalentes. La prueba DeSC requiere un pretratamiento que pueda alterar los trimers anclados por membrana y dar lugar a una forma soluble o desnaturalizada de la glicoproteína22,,29. Por lo tanto, la SRD no es muy eficiente para discriminar entre glicoproteínas inmunogénicas y no inmunogénicas, lo que resulta en una evaluación imperfecta de la inmunogenicidad de un lote de vacunas. Por el contrario, la prueba ELISA es más sensible22, conserva la estructura nativa de la glicoproteína, y es más apropiada para determinar el contenido de los trimers plegados de forma nativa de glicoproteína. La prueba ELISA puede utilizar anticuerpos antiglicoproteínamono monoclonales de conejo o monoclonales de ratón purificados o concentrados con sulfato de amonio. Los estudios han demostrado una buena concordancia entre la prueba de NIH y el contenido de antígeno evaluado por ELISA en vacunas y han concluido que los métodos ELISA son adecuados para la prueba de potencia in vitro. Esto aboga por que las pruebas ELISA puedan al menos complementar o incluso reemplazar la prueba4,26,27,30,31,32,33., Hoy en día, la Farmacopea Europea recomienda el uso de ensayos serológicos o inmunoquímicos validados como alternativas a la prueba3de los NIH. La evasión completa del uso animal para la potencia de la vacuna se ha convertido en una perspectiva realista.
El método que se presenta a continuación se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando un clon de anticuerpos monoclonales de ratón (mAb-D1) que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína rabórica15,,34. Este método fue desarrollado inicialmente en el Institut Pasteur26,30 luego optimizado y validado por el laboratorio Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), es decir, el laboratorio francés OMCL4,,33. El mAb-D1 se utiliza tanto para sensibilizar la placa como para detectar posteriormente el antígeno capturado. Esto permite la cuantificación específica de los recortadores de glicoproteína, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. El mAb-D1 utilizado para la detección está etiquetado con peroxidasa, que se revela en presencia del sustrato y el cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica. Es de destacar que el mismo tipo de ensayo se puede aplicar para diferentes mAbs que reconocen diferentes sitios antigénicos de la glicoproteína RABV35. El método para obtener y purificar o concentrarse con globulinas policlonales de conejo policlonal de sulfato de amonio G (IgG) o monoclonales han sido ampliamente descritos anteriormente36 junto con el método para conjugar anticuerpos con peroxidasa37..

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1523px;" width="1522">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:340px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">10445753</td>
			<td style="width:456px;">if titrating live virus</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:465px;">Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &#181;L, MAXISORP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>439454</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:85px;width:465px;">Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12576606</td>
			<td>for the preparation of sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:113px;width:465px;">Immunology Plate Strong 
			Adsorption MAXISORP Flat Bottom 
			Well F96</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>55303</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate Sealing Tape(100 sheets)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate&#160; single mode reader Sunrise</td>
			<td style="width:340px;">TECAN</td>
			<td style="width:262px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate shaker-incubator</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>441504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate washer Wellwash</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5165000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:465px;">Multichannel pipette (30-300 &#181;L) 12 channels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">4661180N</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:104px;width:465px;">Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &#956;L micro, 2-20 &#956;L, 20-200 &#956;L &#38; 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4700880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency

La creciente preocupación mundial por el bienestar animal está alentando a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (OMCL) a seguir la estrategia 3R s para la sustitución, reducción y refinamiento de las pruebas en animales de laboratorio. Se recomienda el desarrollo de enfoques in vitro a nivel de la OMS y europa como alternativas a la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia. En la superficie de la partícula del virus de la rabia (RABV), los recortadores de glicoproteína constituyen el principal inmunogen para inducir anticuerpos neutralizantes virales (VNAbs). Se ha desarrollado una prueba ELISA, en la que los anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAb-D1) reconocen la forma trimérica de la glicoproteína, para determinar el contenido de la glicoproteína trimérica plegada nativa junto con la producción de los lotes de vacunas. Esta prueba de potencia in vitro demostró una buena concordancia con la prueba de NIH y se ha encontrado adecuada en ensayos colaborativos por fabricantes de vacunas RABV y CLUFs. Evitar el uso animal es un objetivo alcanzable en un futuro próximo.
El método presentado se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando el mAb-D1 que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína RABV trimérica, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. mAb-D1 se utiliza tanto para el recubrimiento como para la detección de recortadores de glicoproteína presentes en el lote de vacunas. Dado que el epítopo es reconocido debido a sus propiedades conformacionales, la glicoproteína potencialmente desnaturalizada (menos inmunogénica) no puede ser capturada y detectada por el mAb-D1. La vacuna a probar se incuba en una placa sensificada con el mAb-D1. Las glicoproteínas RABV recortadas enlazadas se identifican añadiendo el mAb-D1 de nuevo, etiquetado con peroxidasa y luego revelado en presencia de sustrato y cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica.

En el siguiente ejemplo se utiliza la vacuna de referencia Lote 09, que consiste en partículas purificadas del virus de la rabia inactivadas (cepa de vacuna PV). El contenido de los recortadores de glicoproteína (10 g/ml) en esto se ha establecido después de la determinación de la cantidad total de proteínas virales (prueba BCA) y la evaluación del porcentaje de la glicoproteína por electroforesis de gel de sDS-poliacrilamida. Alternativamente, se puede utilizar una vacuna de refer...

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In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Aquí describimos una inmunocaptura indirecta de sándwich ELISA para determinar el contenido de glicoproteína inmunogénica en las vacunas contra la rabia. Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) que reconoce los recortadores de glicoproteína. Es una alternativa a la prueba in vivo de NIH para seguir la consistencia de la potencia de la vacuna durante la producción.

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Con el objetivo de reducir las pruebas con animales y debido a la variabilidad de la prueba NH, la OMS alienta a desarrollar enfoques in vitro para evaluar la potencia de la vacuna antirrábica. Esta prueba ELISA muestra una buena concordancia con una prueba NH clásica en el reconocimiento de la forma inmunogénica de la glicoproteína, muestra una alta sensibilidad, y se puede realizar dentro de un solo día. La evaluación de la potencia de la vacuna antirrábica in vitro por ELISA es una alternativa a la prueba NH in vivo.Está promovido por los fabricantes y laboratorios nacionales de control. Es fundamental distribuir volúmenes de tamaño premétrico por duplicado para cada dilución y secar bien la placa en papel absorbente después de lavados para evitar comenzar este procedimiento, poner en equipo de protección personal adecuado, incluyendo abrigo desechable, guantes, máscara y vasos. Tratar los materiales contaminados sumergiéndolos en una solución de hipoclorito sódico al 2,6% durante 30 minutos para su descontaminación.A continuación, establezca una placa de inmunoensayo de 96 pozos y agregue 200 microlitros del anticuerpo monoclonal diluido en el tampón de carbonato a cada pozo. Cubra la placa con película adhesiva e incubar la microplaca a 37 grados Centígrados durante tres horas en un ambiente humidificado. A continuación, aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un receptor que contenga una solución de hipoclorito sódico al 2,6%.Invierta la microplaca y déjela secar en papel absorbente a temperatura ambiente durante cinco minutos. Primero, agregue 300 microlitros del búfer de pasivación a cada pocóyo. Cubra la placa con película adhesiva e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Después de esto, transferir el contenido del pozo a uno que contenga una solución de 2,6% de hipoclorito sódico. Para lavar la placa, agregue 300 microlitros del tampón de lavado a cada pozo. A continuación, aspirar cuidadosamente y transferir el contenido del pozo a un recipiente que contenga una solución de 2,6% de hipoclorito sódico.Repita este proceso de lavado cinco veces más para lavar ampliamente la placa sensibilizada. Después de esto, invierta la microplaca y déjela secar en un pedazo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto. Reconstituir la vacuna de referencia en un mililitro de agua destilada de forma que la concentración final de glicoproteína del virus de la rabia sea de 10 microgramos por mililitro.Preparar una dilución 10 veces de la vacuna de referencia reconstituida en el diluyente para alcanzar una concentración de glicoproteína del virus de la rabia de un microgramo por mililitro. A continuación, realice seis diluciones en serie dos veces de esta vacuna de referencia en el diluyente, tal como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Distribuir 200 microlitros del diluyente en pozos duplicados para servir como control ciego y 200 microlitros por pozo para cada dilución de vacuna de referencia por duplicado.A continuación, prepare una dilución de 10 veces la vacuna probada en el diluyente y prepare siete diluciones en serie de la vacuna probada en diluyente como se describe en la tabla dos del protocolo de texto. Distribuya 200 microlitros de cada dilución de vacuna probada por duplicado a cada pocótela de la microplaca. Cubra la microplaca con película adhesiva e incubar a 37 grados centígrados durante una hora.Después de esto, retire la película. Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito sódico al 2,7%. Para lavar la placa, añadir 300 microlitros de tampón de lavado a cada pozo, aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito sódico al 2,6%.Repita el proceso de lavado cinco veces más para eliminar el antígeno no unido y conservar los recortadores de proteína G unidos al anticuerpo recubierto. Invierta la microplaca lavada y déjela secar en un pedazo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto. A continuación, distribuya 200 microlitros de la dilución recomendada de peroxidasa etiquetada con anticuerpo monoclonal D1 en diluyente a cada pocóvolo.Cubra la microplaca con película adhesiva e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, retire la película, aspire cuidadosamente y transfiera el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,6%. Para lavar la microplaca, agregue 300 microlitros de tampón de lavado a cada pocóyo.Aspirar cuidadosamente y transferir el contenido de cada pozo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito sódico al 2,6%. Repita este proceso de lavado cinco veces más para eliminar el anticuerpo etiquetado con peroxidasa no enlazada. Invierta la microplaca lavada y déjela secar en un pedazo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto.A continuación, distribuya 200 microlitros de solución de sustrato-cromógeno en cada pozo. Selle la microplaca con película e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. A continuación, agregue 50 microlitros de solución de parada en cada pozo para detener la reacción.Limpie cuidadosamente la parte inferior de la microplaca y colóquela en el espectrofotómetro. Determinar la densidad óptica a 492 nanómetros para todos los pozos utilizados. Recopile estos datos en un archivo de hoja de cálculo para su análisis.Después de esto, cree gráficas tanto para la curva de la vacuna de referencia como para los valores de densidad óptica descritos en el protocolo de texto. En este estudio, la prueba ELISA in vitro se utiliza para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia. Aquí se muestran valores representativos de densidad óptica de un experimento típico.Estos valores se utilizan para dibujar la curva de la vacuna de referencia trazando la densidad óptica media para las diferentes diluciones de la vacuna de referencia en el eje vertical y la concentración de la glicoproteína en el eje horizontal. A continuación, se estima el contenido de glicoproteína de la vacuna analizada utilizando esta curva. La evaluación es precisa para las diluciones que tienen un valor medio de densidad óptica en el área de revestimiento de la curva de la vacuna de referencia.Teniendo en cuenta la dilución de uno a 40, la proyección vertical de OD 1534 en el eje X corresponde a 500 nanogramos por mililitro. Por lo tanto, la vacuna probada se estima en 20 microgramos por mililitro de glicoproteína. Cuando se establece la potencia in vitro, es necesario comparar la vacuna probada con la referencia seis estándares internacionales de la OMS calibrados en unidades internacionales.El mismo método se puede utilizar con otros anticuerpos para ampliar la detección de más cepas vacunales, incluidas las utilizadas en vacunas veterinarias que clásicamente son más variables. Los anticuerpos también se pueden utilizar en la competencia para la valoración de anticuerpos antirabies en el suero equino o humano. Se deben tomar precauciones con vacunas que no estén inactivadas o con virus.Asegúrese de usar equipo de protección personal, usar guantes y descontaminar todo correctamente. Además, tenga cuidado con los comprimidos de ya que son cancerígenos y con la solución ácida de hipoclorito sódico.

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