Name: in vivo functional study of disease-associated rare human variants using drosophila
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00
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Agradecemos a José Salazar, Julia Wang e a Dra Karen Schulze pela leitura crítica do manuscrito. Reconhecemos os Drs. Ning Liu e XI Luo para a caracterização funcional das variantes TBX2 discutidas aqui. O centro de triagem de organismos do modelo de rede de doenças não diagnosticadas foi apoiado pelo fundo comum dos institutos nacionais de saúde (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. foi apoiado ainda pelo NIH [CNCDP-K12 e NINDS (1K12 NS098482)], Academy americano do Neurology (concessão da pesquisa do Neuroscience), fundo do Wellcome de Burroughs (concessão da carreira para cientistas médicos), sociedade da neurologia da criança e Fundação da neurologia da criança ( PERF Elterman), e o prêmio de independência antecipada do diretor da NIH (DP5 OD026426). M. F. W. foi apoiado pela Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. foi apoiado pela NIH (R01 DC014932), a Fundação Simons (SFARI Award: 368479), a associação de Alzheimer (novo investigador Research Grant: 15-364099), naman família fundo para a investigação básica, e Caroline Wiess lei fundo para a investigação em Medicina molecular. A microscopia confocal em BCM é apoiada na parte por NIH Grant U54HD083092 ao núcleo do Neurovisualization do centro de pesquisa das inabilidades intelectuais e desenvolventes (IDDRC).

1. coleta de informações humanas e MO para avaliar: probabilidade de uma variante de interesse ser responsável por fenótipos de doenças e viabilidade de estudos funcionais em Drosophila
<ol><li>Realize pesquisas extensas de banco de dados e literatura para determinar se os genes e variantes de interesse específicos são bons candidatos para explicar o fenótipo do paciente de interesse. Especificamente, reúna as seguintes informações.
	<ol>
<li>Avalie se o gene do interesse estêve im...

Estudos experimentais utilizando Drosophila melanogaster proporcionam um sistema de ensaio robusto para avaliar as consequências das variantes humanas associadas à doença. Isto é devido ao grande corpo do conhecimento e das ferramentas genéticas diversas que foram geradas por muitos investigadores no campo da mosca sobre o século passado89. Assim como qualquer outro sistema experimental, no entanto, é importante reconhecer as advertências e limitações que existem.
<p class="...

Pacientes com doenças raras muitas vezes passam por uma árdua jornada referida como a "Odisseia diagnóstica" para obter um diagnóstico preciso1. A maioria de doenças raras são pensados para ter uma origem genética forte, fazendo análises genéticas/genomic elementos críticos do workup clínico. Além do que o seqüenciamento do painel do gene do candidato e a análise da variação do número da cópia baseadas em Microarrays cromossomáticos, as tecnologias Whole-exome (WES) e do inteiro-genoma que sequenciam (WGS) tornaram-se ferramentas cada vez mais valiosas sobre a década passada2, a 3. Atualmente, a taxa diagnóstica para identificar uma variante patogênica conhecida em Wes e WGS é de ~ 25% (maior em casos pediátricos)4,5. Para a maioria de casos que permanecem undiagnosed após WES/WGS clínico, uma edição comum é que há muitos genes e variants do candidato. O sequenciamento da próxima geração geralmente identifica variantes novas ou ultramodernas em muitos genes, e interpretar se essas variantes contribuem para fenótipos de doença é desafiador. Por exemplo, embora a maioria de mutações do absurdo ou do Frameshift nos genes sejam pensadas para ser perda--função (LOF) alelos devido à deterioração absurdo-negociada da transcrição codificada, as mutações truncando encontradas nos últimos exons escapam este processo e podem funcionar como alelos benignos ou de ganho de função (GOF)6.
Além disso, prever os efeitos de um alelo missense é uma tarefa assustadora, uma vez que pode resultar em um número de diferentes cenários genéticos como descrito pela primeira vez por Herman Muller na década de 1930 (ou seja, amorfo, hipomorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo, ou isomorph)7 . Numerosos em programas de silico e metodologias foram desenvolvidos para prever a patogenicidade de variantes missense com base na conservação evolutiva, tipo de mudança de aminoácidos, posição dentro de um domínio funcional, alelo freqüência na população geral, e outros parâmetros8. No entanto, esses programas não são uma solução abrangente para resolver o problema complicado de interpretação variante. Curiosamente, um estudo recente demonstrou que cinco algoritmos de predição de patogenicidade variante amplamente utilizados (PolyPhen9, Sift10, CADD11, provean12, provador de mutação) concordam com a patogenicidade ~ 80% do tempo8 . Notavelmente, mesmo quando todos os algoritmos concordam, eles retornam uma predição incorreta de patogenicidade até 11% do tempo. Isto conduz não somente à interpretação clínica defeituada mas igualmente pode dissuadir investigadores de seguir acima em variants novos falsamente alistando os como benignos. Uma forma de complementar a atual limitação da modelagem em silico é fornecer dados experimentais que demonstre o efeito da função variante in vitro, ex vivo (por exemplo, células cultivadas, organóides) ou in vivo.
Estudos funcionais in vivo de variantes associadas a doenças raras em MO têm pontos fortes únicos13 e foram adotados por muitas iniciativas de pesquisa de doenças raras em todo o mundo, incluindo a rede de doenças não diagnosticadas (UDN) nos Estados Unidos e Rare Modelos de doenças & mecanismos (RDMM) redes no Canadá, Japão, Europa e Austrália14. Além desses esforços coordenados para integrar pesquisadores de MO no fluxo de trabalho de diagnóstico de doenças raras e estudos mecanísticos em escala nacional, vários estudos colaborativos individuais entre pesquisadores clínicos e de MO levaram à descoberta e caracterização de muitos novos genes causadores de doenças humanas e variantes82,83,84.
Na UDN, um centro de triagem de organismos modelo centralizado (MOSC) recebe submissões de genes candidatos e variantes com uma descrição da condição do paciente e avalia se a variante é susceptível de ser patogênica usando ferramentas de informática e in vivo Experiências. Na fase I (2015-2018) da UDN, o MOSC é composto por um núcleo de Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] e zebrafish Core (Universidade do Oregon) que trabalharam colaborativamente para avaliar os casos. Usando a análise informática e um número de estratégias experimentais diferentes na Drosophila e no zebrafish, o Mosc contribuiu até agora ao diagnóstico de 132 pacientes, identificação de 31 síndromes novas55, descoberta de diversos seres humanos novos genes da doença (por exemplo, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) e expansão fenotípica da doença conhecida genes (por exemplo, CACNA1A,21ACOX122).
Além de projetos dentro da UDN, os pesquisadores do núcleo de Drosophila da Mosc contribuíram para novas descobertas genéticas de doenças em colaboração com os centros de genômica mendeliana e outras iniciativas (por exemplo, ANKLE2,23, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) usando o mesmo conjunto de informática e genética estratégias desenvolvidas para a UDN. Dado o significado de estudos do MO no diagnóstico raro da doença, o MOSC foi expandido para incluir um núcleo de C. elegans e o segundo núcleo de zebrafish (ambos na Universidade de Washington em St. Louis) para a fase II (2018-2022) do UDN.
Este manuscrito descreve um protocolo de estudo funcional in vivo que é usado ativamente no núcleo de Drosophila da UDN Mosc para determinar se as variantes de missense têm conseqüências funcionais sobre a proteína de interesse usando moscas transgênicas que expressam Proteínas. O objetivo deste protocolo é ajudar os pesquisadores de MO a trabalharem colaborativamente com grupos de pesquisa clínica para fornecer evidências experimentais de que uma variante candidata em um gene de interesse tem conseqüências funcionais, facilitando assim o diagnóstico clínico. Este protocolo é o mais útil em um Scenario em que um investigador da Drosophila é aproximado por um investigador clínico que tenha um paciente raro da doença com uma variação específica do candidato em um gene do interesse.
Este protocolo pode ser dividido em três elementos: (1) coletar informações para avaliar a probabilidade de a variante de interesse ser responsável pelo fenótipo do paciente e a viabilidade de um estudo funcional em Drosophila, (2) coleta instrumentos genéticos existentes e estabelecer novos, e (3) realizar estudos funcionais in vivo. O terceiro elemento pode ser subdividido em dois subelementos com base em como a função de uma variante de interesse pode ser avaliada (experimento de resgate ou estratégias baseadas em superexpressão). É importante notar que este protocolo pode ser adaptado e otimizado para muitos cenários fora da rara pesquisa de doença monogênica (por exemplo, doenças comuns, interações gene-ambiente e telas farmacológicas/genéticas para identificar alvos terapêuticos). A capacidade de determinar a funcionalidade e a patogenicidade das variantes não só beneficiará o paciente de interesse, fornecendo um diagnóstico molecular preciso, mas também terá impactos mais amplos na pesquisa científica translacional e básica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1091px;" width="1090">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:705px;">Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="54" style="height:54px;width:325px;">Injection strains for transgenesis (D. melanogaster)</td>
			<td style="width:189px;">BDSC</td>
			<td style="width:191px;">#24871</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="54" style="height:54px;width:325px;">Injection strains for transgenesis (D. melanogaster)</td>
			<td height="25" style="height:25px;width:189px;">BDSC</td>
			<td style="width:191px;">#24872</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:705px;">Plasmid DNA</td>
			<td style="width:385px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:325px;">Cloning vector</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:191px;">#12536-017</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: pDONR221</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:325px;">Drosophila transgenesis vector</td>
			<td style="width:380px;">Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)</td>
			<td></td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: pGW-HA.attB</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:705px;">Molecular biology kits and reagents</td>
			<td style="width:385px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:325px;">Agarose</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">#A2790</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:325px;">Chemically Competent Cells (E. coli)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:191px;">#18265017</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: DH5&#945;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:325px;">DNA Gel Extraction kit</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:191px;">#K210012</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:325px;">DNA Isolation and purification kit</td>
			<td style="width:189px;">Qiagen</td>
			<td style="width:191px;">#27104</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:325px;">High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:189px;">NEB</td>
			<td style="width:191px;">#M0491</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: Q5 Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="75" style="height:75px;width:325px;">Recombinase mediated cloning system</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:191px;">#11789020</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="75" style="height:75px;width:325px;">Recombinase mediated cloning system</td>
			<td height="50" style="height:50px;width:189px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:191px;">#11791100</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:325px;">Site Directed Mutagenesis kit</td>
			<td style="width:189px;">Agilent</td>
			<td style="width:191px;">#200523</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:705px;">Electroretinogram Rig related equipment</td>
			<td style="width:385px;"></td>
			<td style="width:385px;"></td>
			<td style="width:385px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:325px;">ERG Analysis</td>
			<td style="width:189px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:325px;">ERG Data Collection</td>
			<td style="width:189px;">LabX</td>
			<td style="width:191px;">#R150358</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:325px;">ERG Stimulator</td>
			<td style="width:189px;">Astro-Med</td>
			<td style="width:191px;">#S48</td>
			<td style="width:385px;">Specific Reagent: Square Pulse Stimulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo functional study of disease-associated rare human variants using drosophila

Os avanços na tecnologia de sequenciamento tornaram os conjuntos de dados de todo o genoma e todo-exome mais acessíveis tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa genética humana de ponta. Embora vários algoritmos de silico tenham sido desenvolvidos para prever a patogenicidade das variantes identificadas nesses conjuntos de dados, os estudos funcionais são fundamentais para determinar como as variantes genômica específicas afetam a função protéica, especialmente para o missense Variantes. Na rede de doenças não diagnosticadas (UDN) e outros consórcios de pesquisa de doenças raras, os organismos modelo (MO), incluindo a Drosophila, C. elegans, zebrafish e camundongos, são usados ativamente para avaliar a função da doença putativa humana-causando Variantes. Este protocolo descreve um método para a avaliação funcional de variações humanas raras usadas no núcleo da Drosophila do centro de seleção dos organismos modelo do UDN. O fluxo de trabalho começa com a coleta de informações humanas e de MO de vários bancos de dados públicos, usando o recurso da Web MARRVEL para avaliar se a variante é susceptível de contribuir para a condição de um paciente, bem como projetar experimentos eficazes com base em disponíveis conhecimento e recursos. Em seguida, são geradas ferramentas genéticas (por exemplo, linhas T2A-GAL4 e UAS-Human cDNA) para avaliar as funções de variantes de interesse na Drosophila. Em cima do desenvolvimento destes reagentes, os ensaios funcionais Two-pronged baseados em experimentos do salvamento e da superexpressão podem ser executados para avaliar a função variante. No ramo de resgate, os genes de mosca endógena são "humanizados" substituindo o gene da Drosophila ortologosa por transgenes humanos de referência ou variante. No ramo de superexpressão, as proteínas humanas de referência e variante são conduzidas exogenamente em uma variedade de tecidos. Em ambos os casos, todo o phenotype pontuáveis (por exemplo, letalidade, morfologia do olho, electrophysiology) pode ser usado como uma leitura-para fora, independentemente da doença do interesse. As diferenças observadas entre os alelos de referência e variantes sugerem um efeito variante-específico e, portanto, provável patogenicidade. Este protocolo permite avaliações rápidas, in vivo, de variantes de genes causadores de doenças humanas putativas com funções conhecidas e desconhecidas.

Estudo funcional de de novo variante missense em EBF3 ligado a fenótipos de neurodesenvolvimento Em um macho dos anos de idade 7 com os fenótipos do neurodesenvolvimento que incluem a hipotonia, a ataxia, o atraso desenvolvente global, e a desordem de discurso expressivo, os médicos e os geneticistas humanos nos institutos nacionais da saúde projeto das doenças undiagnosed (UDP) identificou uma variante de missense de novo (p. R163Q) em EBF3 (Early b-Cell factor 3)<sup ...

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In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

O objetivo deste protocolo é delinear o desenho e o desempenho de experimentos in vivo em Drosophila melanogaster para avaliar as conseqüências funcionais de variantes genéticas raras associadas a doenças humanas.

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Este protocolo nos permite determinar se variantes missense em genes humanos que estão ligadas a doenças afetam a função proteica. Isso é difícil de conseguir computacionalmente mesmo com algoritmos de última geração. Esta técnica permite uma análise rápida das variantes missense em proteínas humanas usando um sistema in vivo Drosophila melanogaster que é mais rápido e mais econômico do que organismos modelo vertebrados.Demonstrar que uma variante específica afeta a função proteica contribui diretamente para o diagnóstico de doenças raras e serve como ponto de partida para a análise do mecanismo da doença e terapias potenciais. Este protocolo é particularmente útil ao estudar variantes ligadas a doenças raras, mas pode ser aplicado a doenças mais comuns como autismo e câncer. Identificar fenótipos reprodutíveis em moscas que refletem a função proteica pode ser um desafio.Os fenótipos podem variar de gene para gene e podem ser sutis. Estudos funcionais de variantes em proteínas humanas usando Drosophila podem ser realizados com base em experimentos de resgate ou estudos de superexpressão. Antes de iniciar o procedimento, reúna informações sobre o gene humano de interesse e seus ortologs organismo modelo.Para testar a função variante, superexpressando referências e variantes de proteínas humanas no sistema visual de mosca, gerar moscas transgênicas que expressam referência ou variante de cDNAs humanas de interesse sob o controle da sequência de ativação gal4 upstream ou sistema UAS. Para selecionar uma linha Gal4 específica para expressar as proteínas humanas em um tecido de mosca específico, cruze de três a cinco fêmeas virgens da linha Gal4 com três a cinco machos de cada uma das linhas transgênicas cDNA humanas da UAS em frascos únicos ou em duplicatas. Transfira as cruzes a cada dois ou três dias para obter o maior número possível de animais que se aproximam de uma única cruz e examinar o animal eclosado sob um microscópio de dissecção para identificar quaisquer diferenças entre as cepas de referência e variantes.Se houver um defeito visível, imagem as moscas para documentar os fenótipos. Para gerar moscas para testar defeitos funcionais no sistema visual, cruzam fêmeas virgens da linha rhodopsin 1 Gal4 para machos com referência ou variante UAS transgenes humanos para expressar as proteínas humanas de interesse nos fotoreceptores R1 a R6 na retina mosca. Uma vez que as moscas começam a eclose, reúna a prole em frascos frescos e devolva os frascos a uma incubadora definida à temperatura experimental apropriada por mais três dias para permitir que o sistema visual amadureca.No final da incubação, imobilize as moscas com um método de anestesia apropriado e cole suavemente um lado de cada mosca em um slide de microscópio de vidro. Depois de montar uma plataforma de eletroretinograma, coloque um capilar de vidro de 1,2 milímetros em um puxador de agulha e quebre o tubo capilar para obter dois eletrodos afilados ocos afiados com menos de 0,5 milímetros de diâmetro. Encha os capilares com solução salina de 100 mililitros, tomando cuidado para evitar bolhas de ar e deslize os capilares de vidro sobre os eletrodos de fio de prata.Fixar os capilares no lugar e aclimatar as moscas para completar a escuridão por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. No final da habituação, coloque o slide contendo as moscas sobre o aparelho de gravação e mova os micromanipuladores carregando a referência e registrando eletrodos próximos à mosca de interesse. Observando a ponta do eletrodo, coloque cuidadosamente o eletrodo de referência no tórax da mosca penetrando na cutícula e coloque o eletrodo de gravação na superfície do olho.Para gravações de eletroretinograma bem sucedidas, tome cuidado para aplicar uma quantidade adequada de pressão ao eletrodo de gravação para que ele cause uma pequena covinha sem penetrar no olho. Quando os eletrodos tiverem sido colocados, desligue a luz primária por três minutos para reaclimatar as moscas ao ambiente escuro. No final do período de re-aclimatação, abra e feche o obturador uma vez por segundo durante 20 segundos registrando os eletroretinogramas de pelo menos 15 moscas por deslizamento por genótipo por condição usando os mesmos eletrodos.Quando as gravações da referência e da variante voarem completas, compare as gravações de eletroretinograma da referência, variante e controles para avaliar as diferenças. Em seguida, avalie os dados do eletroretinograma para alterações nos transitórios, despolarização, off transitórios e repolarização. Neste experimento representativo, foram realizados estudos baseados em superexpressão para TBX2, uma vez que a referência humana TBX2 não foi capaz de substituir funcionalmente o gene ortologos da mosca, tornando impossível estratégias baseadas em resgate.Quando a referência tbx2 humana foi superexpressa no olho em desenvolvimento e partes do cérebro usando Gal4 sem olhos, a superexpressão resulta em uma mortalidade de aproximadamente 85% e uma redução significativa no tamanho dos olhos. Em contraste, a variante transgene é menos potente em causar letalidade e induz um pequeno fenótipo ocular usando o mesmo motorista em condições experimentais idênticas sugerindo que a variante afeta a função proteica. Além disso, quando um TBX2 humano de referência é superexpresso nos fotorreceptores usando rhodopsin Gal4, a superexpressão causa uma alteração significativa no traço do eletroretinograma.Este fenótipo é mais suave quando a proteína variante é expressa fornecendo mais evidências de que a variante de interesse afeta a função proteica in vivo. É importante notar que cada gene é único para que não haja um único experimento que possa avaliar o impacto de todas as variantes associadas à doença. Além de trabalhar com cDNAs humanos, pode-se determinar se a variante tem consequências funcionais introduzindo variantes análogas em resíduos evolutivamente conservados do gene da mosca ortologos.Usando esse método, contribuímos para uma série de estudos de descoberta de genes de doenças humanas em colaboração com a Rede de Doenças Não Diagnosticadas e outros grupos.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Genética

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

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Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Medição de níveis de exercício em Drosophila melanogaster , usando o sistema de quantificação de exercício de giro (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...