Name: fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

אנו מודים לדוד הוס על תובנות מועילות בעבודה זו. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מלגת מחקר הקיץ של קרן רוז הילס (2016-2018) ומלגת מחקר של אוניברסיטת דרום קליפורניה ל-ת, מכון מחקר סבן במסגרת הכשרת טרום-דוקטורט לרפואה, ואוניברסיטת דרום קליפורניה מחקר הסמכה עמיתים התוכנית פרס ר

כל הליכי החיות בוצעו בהתאם הנחיות מאושרות מבית החולים לילדים לוס אנג'לס ואוניברסיטת דרום קליפורניה טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות השימוש.
1. הדור ביטוי מבוסס pCS2 וקטורים
<ol><li>
לשכפול pCS2. Lifeact-eGFP, להכין את עמוד השדרה וקטור על ידי עיכול 2 μg של pCS2. CycB1-GFP (בונה המכיל הוספה אחרת...

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+biology:+methods,+applications,+and+instrumentation.">Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation.</a> Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).</li><li>Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Direct+Gene-Transfer+to+Plants.">High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants.</a> Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).</li><li>Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Ovo+Electroporation+of+DNA+Vectors+into+Pre-gastrulation+Avian+Embryos.">Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos.</a> CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>Voiculescu, O., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+Gene+Expression+in+the+Chick+Embryo.">Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo.</a> Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).</li><li>Chuai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+during+chick+primitive+streak+formation.">Cell movement during chick primitive streak formation.</a> Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).</li><li>Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color,+4-D+time-lapse+confocal+imaging+of+chick+embryos.">Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos.</a> Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).</li><li>Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta-globin+pre-mRNA+synthesized+in+vitro+is+accurately+spliced+in+Xenopus+oocyte+nuclei.">Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei.</a> Cell. 32 (3), 681-694 (1983).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).</li><li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics.">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).</li><li>Bugeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+efficient+transfection+of+mouse+neural+stem+cells+and+mature+neurons+by+in+vivo+mRNA+electroporation.">Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation.</a> Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).</li><li>Krieg, P. A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+messenger+RNAs+are+produced+by+SP6+in+vitro+transcription+of+cloned+cDNAs.">Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.</a> Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Eyal-Giladi, H., Kochav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cleavage+to+primitive+streak+formation:+a+complementary+normal+table+and+a+new+look+at+the+first+stage+of+the+development+of+the+chick.+I.+General+morphology.">From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology.</a> Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).</li><li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+the+Japanese+quail.">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>New, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+cultivation+of+the+chick+embryo+in+vitro.">A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).</li><li>Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+beta+1+integrin-mediated+adhesions+results+in+altered+somite+cell+shape+and+behavior.">Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior.</a> Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+vascular+morphogenesis+using+transgenic+quail+embryos.">Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+polarity+does+not+correlate+with+speed+or+persistence+of+freely+migrating+fibroblasts.">Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+microscopy+of+DNA.">Fluorescence labeling and microscopy of DNA.</a> Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+spectroscopy+and+dynamics+of+intrinsically+fluorescent+proteins:+coral+red+(dsRed)+and+yellow+(Citrine).">Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine).</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).</li><li>Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+de+novo+chromophore+maturation+of+fluorescent+proteins.">Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+turnover+in+eukaryotes:+pathways+and+enzymes.">Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Harland, R., Misher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+RNA+in+developing+Xenopus+embryos+and+identification+of+a+destabilizing+sequence+in+TFIIIA+messenger+RNA.">Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA.</a> Development. 102 (4), 837-852 (1988).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+road:+peering+into+live+cells.">The long road: peering into live cells.</a> Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).</li><li>Sato, Y., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+and+imaging+in+birds,+and+available+transgenic+reporter+lines.">Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).</li><li>Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).</li></ol>

בפרוטוקול זה, סיפקנו צעד אחר צעד הוראות על איך בדיוק מיקרו הזרקת ו אלקטרופורטה mRNA לתוך התאים של עוברי שליו הגאוגעיים. הדגמנו כי בתוך מתורבת מסונתז mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים (איור 2 ו -3). קרינה פלואורסצ?...

אלקטרופורציה היא שיטת העברה פיזית המשתמשת בפולס חשמלי כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום הפלזמה, המאפשר חומרים כמו חומצות גרעין או כימיקלים לעבור לתוך ציטוסול. אלקטרופורציה משמשת רבות כדי לספק דנ א לתוך חיידקים, שמרים, צמחים, ותאים מהיונקים1,2,3. הוא משמש באופן שגרתי כדי להחדיר מדים גנטיים לתוך תאים ורקמות היעד בתוך העובר העופות המתפתח ללמוד את השליטה הגנטית של פיתוח או תווית הגירה אוכלוסיות של תאים4,5,6, 7. לאחר מכן עם זאת, מספר מגבלות נסיוניות קיימות גם עם אלקטרופורציה DNA8. למשל, אלקטרופורציה DNA מציג לעתים קרובות מספר משתנה מאוד של וקטורים ביטויים לכל תא ולאחר מכן mRNAs וחלבונים הם לקודד. השונות הזאת עלולה להוביל לטרוגניות משמעותית בתאי התא, המסבך את ניתוח התמונה ואת פרשנות הנתונים9,10. בנוסף, חלבונים מ-DNA אלקטרופורציה רק מתחילים לבטא ~ 3 h פוסט אלקטרופורציה ולא להגיע ליעילות המקסימלית של מספר התא ואת עוצמת הקרינה עד 12 h, כנראה בשל הזמן הנדרש להעביר לתוך הגרעין ולהשלים תמלול ותרגום בvivo11.
לעומת זאת, השימוש ב-mrna משמש באופן יעיל במגוון מערכות מודל, כולל xenopus זריזה oocytes על ידי מיקרוהזרקה12,13, התכנות משנה את תאי הגזע האנושי על ידי mrna lipofectamine החצייה14 , ומרדנות בתאי גזע עצביים בעכברים למבוגרים15. בדקנו את היכולת של mrna אלקטרופורציה כדי לתייג ביעילות תאים במהלך פיתוח מוקדם העופות מתחלקים באמצעות מסונתז mrna באופן מתורבת לקודד חלבונים פלורסנט ברורים (FPs). ללימודים שלנו, השתמשנו pCS2 + וקטור, וקטור ביטוי רב-תכליתי המשמש בדרך כלל להבעת חלבונים ב xenopus ו-דג זברה עוברי. ה-RNA פולימו T7 מיזמים בpCS2 + היתר את הסינתזה של mRNA וחלבון מכל גן משוכפל כאשר משתמשים ב תמלול/מערכת תרגום של מבחנה.
כאן, אנו מדגימים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים. עיצבנו ויצרנו רבים מוקטורי הביטוי בהם נעשה שימוש במחקרים אלה. לדוגמה, אנו שיכלנו משנה את הגן LifeAct-eGFP16 לתוך pCS2 + וקטור17 לבטא מן היזם CMV ו-SP6 מקדם. הגן המוסף נמצא במורד הזרם של מקדם SP6 ובמעלה הזרם של הזנב SV40 פולי (A)18. ב עוברים שיתוף electroporated עם mRNA ו-DNA, FPs מקודד מ-Mrna המועתק מחוץ לתחום שזוהו לראשונה בתוך 20 דקות של אלקטרופורציה, בעוד FPs של וקטורים ביטוי DNA אותרו רק לאחר 3 h. קידוד Mrna מרובים עבור גרעיני, Golgi, ו חלבונים קרום יכול להיות electroporated לתוך העובר בו זמנית, וכתוצאה מכך ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בתאים בודדים. בסופו של דבר, באמצעות התאוששות vivo פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) שיטת, אנו מראים כי רוב הריקבון Mrporated הדעיכה בתוך 2 h. כך, ייצור חלבון ראשוני מהיר בשילוב עם תרגום חלבון חדש מוגבל הופך את mrna אלקטרופורציה טכניקה רבת ערך כאשר השליטה הטמפורלית של הביטוי הוא הכרחי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrG1-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3138L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No.1 filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmTurquoise2-Golgi</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36205</td>
			<td>pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmEGFP-N1-LifeAct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2.Lifeact-mGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>This paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.H2B-citrine</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>53752</td>
			<td>pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS.memb-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#53750</td>
			<td>pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-780 inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td></td>
			<td>The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (&#62;4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY-21 EDIT in vivo electroporator</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum flat square electrode, side length 5 mm</td>
			<td>Bex Co., Ltd.</td>
			<td>LF701P5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10 FL Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 Monochrome camera</td>
			<td>Olympus LifeScience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10&#215;, pH 7.4) </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To prepare 1 L of a 10&#215; stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.37 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mM KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/Triton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10&#215; PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-&#956;m filter and store it at 4 &#778;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast and efficient expression of multiple proteins in avian embryos using mrna electroporation

אנו מדווחים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר חלבונים פלורסנט כדי לתייג תאים בעוברי שליו חיים במהירות רבה יותר ובאופן נרחב יותר אלקטרופורציה DNA. היעילות הגבוהה ביותר מאפשרת לפחות 4 mRNAs ברורים להיות שיתוף מעבר עם ~ 87% יעילות. רוב מוצרי ה-mRNAs החשמליים מפוקעים במהלך 2 השעות הראשונות של הפוסט-אלקטרופורציה, ומאפשרות ניסויים תלויי זמן להתבצע בעובר המתפתח. בסופו של דבר, אנו מתארים כיצד התמונה באופן דינאמי בשידור חי העוברים עם mRNAs כי קידוד שונים ממוקד חלבונים פלורסנט ממוקדות.

mRNA אלקטרופורציה יעילה יותר מאלקטרופורציה של DNA
השתמשנו pCS2 +. H2B-סיטרין כדי להכין ב-mRNA העתק מבחנה. מאז ה-DNA אלקטרופורציה מבוצע בדרך כלל ב 1-2 μg/μl, השתמשנו ריכוז שווה ערך של mrna (מחושב להיות סביב 0.25-0.5 μg/μl עבור H2B-סיטרין) עבור mrna אלקטרופור...

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation at JoVE.com

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

אנו מדווחים על שליח RNA (mrna) אלקטרופורציה כשיטה המאפשרת ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים במערכת דגם העובר שליו. שיטה זו ניתן להשתמש כדי לתייג תאים במהירות ולהקליט את התנועות שלהם vivo על ידי הזמן לשגות המיקרוסקופיה זמן קצר לאחר electroporation.

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

אלקטרופוזיה mRNA מספקת ביטוי מהיר, יעיל, מבוקר מרחבית ותכופת של חלבונים מרובים בתוך מערכת מודל העופות. שיטה זו מאפשרת ביטוי רחב ומהיר יותר של חלבונים פלואורסצנטיים מאשר התיוג שהושג על ידי אלקטרופורציה DNA סטנדרטית. אלקטרופורציה מקלה על פתיחה בלתי עבורה של נקבוביות בממברנה הפלזמה המשמשות צינורות להעברת מטענים גנטיים כמו RNA ו- DNA לתאים של אורגניזמים מודל רבים.עבור הניסויים הראשונים לעבוד עם עוברים כי הם מבוגרים יותר מיום מאז הם קשים יותר ועמידים יותר מניפולציות חיצוניות כמו אלקטרופורציה. בשלב ההתפתחותי העוברי המתאים נשברים בעדינות ויוצקים את תכולת ביצת השליו לתוך צלחת פטרי באורך 10 ס"מ. השתמש פיפטה העברה כדי להסיר את רוב האלבום עבה.השתמש ברקמת מעבדה כדי לנגב בעדינות את פני השטח של עול כדי להסיר את האלבום העבה הנותר סביב העובר כדי להבטיח שהעובר יידבק בחוזקה לטבעת הנייר. מניחים נייר מסנן precut מעל העובר ולהשתמש מספריים לחתוך בצורה חלקה סביב ההיקף של העובר. השתמש פיפטה פסטר לשכב PPS מתחת לעובר באמצעות זרמים עדינים כדי לפנות כל עול דבק לרקמה.משוך באיטיות את טבעת נייר העובר בזווית אלכסונית למעלה ומן עול. מניחים את הנייר לתוך צלחת פטרי מלא PBS לניקוי נוסף. לאחר שרוב עול הוסר, למקם את הצד הגחוני העובר למעלה בצלחת פטרי 35 מילימטר מכוסה תערובת חצי סולידי של אגר אלבומן.הכן את תא האלקטרופולציה על ידי חיבור האלקטרודה השחורה הממלאת אותו ב- PBS והצבת העובר בפנים. השתמש microcapillary זכוכית להזריק בולוס של 200 nanoliters של mRNA לתוך החלל בין האפיבלסט קרום vitelline מכסה את האזור הרצוי. ואז להשתמש באלקטרודה האדומה כדי אלקטרופולאט העובר.מניחים את העובר האלקטרופוי בחזרה על תערובת אגר-אלבומן ודגירה ב 38 מעלות צלזיוס עד השלב ההתפתחותי הרצוי. להדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים אלקטרופורציה להתבונן בכל העוברים אלקטרופולציה תחת סטריאוסקופ חיטוי פלואורסצנטי כדי לבחור את העובר הבריא ביותר ואת האלקטרופוציה הטובה ביותר עבור ניסויי הדמיה דינמית. המשך להתהגר בעוברים אלקטרופלסטיים אחרים ועוברים שאינם אלקטרופלציה באינקובטור נפרד.שטפו בקצרה את העובר שנבחר עם PBS כדי להסיר את כל הבועות שאולי נוצרו בצד הגבי של העובר במהלך האלקטרופוריה. מניחים את העובר ניקה ישירות לתוך צלחת הדמיה המכיל שכבה דקה של כ 150 microliters של אלבומן אגר דואג לא ליצור בועות על פני הגב של העובר. מוסיפים חתיכת נייר טישו קטנה ומגולגלת לאורך הקצוות הפנימיים של צלחת ההדמיה.לאטום את המנה עם סרט פרפין כדי למזער את האידוי במהלך ההדמיה ואת הדגירה. מעבירים את המנה במהירות לשלב טרום המלחמה של מיקרוסקופ קונפוקל ולהשתמש בערוץ brightfield כדי לאתר את הצבע הצבעוני בעובר. הגדר את תוכנת ההדמיה למטרה הרצויה, מראה דיכרואית וספקטרום פליטה, והפעיל לייזר מתאים.יש לדאוג כי התאים יישארו בראיית התמונה עבור כל הסרט. השתמש ברזולוציית דימות גבוהה מספיק, וודא שתנאי ההדמיה לא יגרמו לפוטוטוקסיות. לחץ על לחיות בתוכנת ההדמיה ולהתאים את כוח הלייזר להגדרה המתאימה לעוצמת הפלואורסצנטיות בהתאם לכל כוח לייזר מיקרוסקופ.התחל לדמיין את העובר באמצעות כוח לייזר של 1% והגדלת 800, והגדל את כוח הלייזר לאט במרווחים של 1% עד שניתן יהיה לראות פיקסלים רוויים. כאשר פיקסלים רוויים נצפו להקטין את כוח הלייזר מעט עד פיקסלים רוויים לא ניתן לדמיין. תמונה העובר כל שלוש עד חמש דקות כדי לבדוק את הנדידה של תאים בודדים על פני נקודות זמן שונות באמצעות חמש מיקרומטר Z-ערימות של האזור האלקטרופלסטי כולו עם קצת מקום נוסף לכיוון החלק התחתון של מחסנית Z במקרה העובר שוקע לתוך המיטה התעוררה במהלך הפגישה הדמיה.כדי לבחון כמה מהר התאים נעים לבדוק את נקודות הזמן הראשונות של הסרט הראשון. אם התאים נעים בקצב מהיר, שקול להרחיב את גודל התצוגה של אזור התמונה או להדמיית אזור אחר. כאשר כל האזור האלקטרופלסטי של העובר כבר בתמונה, תמונה באזור לא נבחר של אותו עובר כדי לקבוע את רמות שפעת אוטומטית.כדי לקבוע כמה זמן mRNA מפוסל יכול להיות מתורגם חלבונים פלואורסצנטיים לאחר אישור אלקטרופולציה של הגן של עניין על מיקרוסקופ סטריאו, מניחים את העובר על שלב שחומם מראש של מיקרוסקופ קונפוקל הפוך ולהשתמש לייזר 405 ננומטר עם כוח לייזר 70%, 100 איטרציות, ומהירות סריקה של ארבעה כדי photobleach רוב הפלואורסצנטיות התאית מן הגן electroplated במגוון נקודות זמן. המשך להחגירה העוברים על הבמה ב 36 מעלות צלזיוס לאחר הלבנת תמונה, דואג לשים לב לתאים המפרידים באופן פעיל בתוך האזור photobleached כי הם בדרך כלל רק לראות עוברים בריאים ובכך עולה כי אלקטרופוריה לא לפגוע בתאים העובריים. רכוש תמונות לאחר אקונומיקה Z-מחסנית של האזור electroplated למשך הזמן הרצוי במרווחי זמן קבועים שלוש עד חמש דקות.כדי להבטיח שתנאי ההדמיה לא ישפיעו באופן מחק על הישרדות העובר במקביל, דגירה של עוברים אלקטרופלסטיים שלא פוטובלצ'ים ישמשו כבקרה על ההדמיה. כדי לכמת את תוצאות photobleaching עבור ריקבון mRNA לאחר אלקטרופולציה להשתמש ImageJ כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של עיגול 7.5 מיקרומטר במרכז האזור electroplated של כל תא כדי לעקוב אחר פלואורסצנטיות התא על פני כל מרווח של שלוש עד חמש דקות. כאשר נמדדו כל התאים באזור הפוטובלצ'ים שאינם עוברים מיטוזה וצילום מלא, עלו על עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן לאחר אקונומיקה בכל אחת מנקודות הזמן שהעובר נוהם.למרות אלקטרופורציה DNA מוביל פלואורסצנטיות בהירה יותר בתאים מסוימים electroplated, היעילות של אלקטרופורציה DNA הוא נמוך יותר בעליל בהשוואה לחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים mRNA. כאשר משווים דנ"א ואלקטרופוזיה שותף mRNA בתוך אותו עובר, ה-DNA המבטא יעילות חלבון פלואורסצנטי הוא גם משמעותי ועקבי פחות יעיל מזה של mRNA המבטא חלבון פלואורסצנטי. כימות של כל העוברים electroplated עם mRNA בלבד, DNA או שילוב של השניים, מגלה כי mRNA משנה כ 75% מהתאים באזור נתון, בעוד DNA רק חוצה כ 25% מהתאים.mRNA מנוקט צריך להוביל לייצור חלבון מהיר יותר לעומת DNA מנוקט מאז mRNA יכול להיות מזוהה מיד על ידי מכונות תרגום cytosolic. למרות אלקטרופוזיה שותף של DNAs מרובים הוכח בעבר להיות יעיל יחסית, אלקטרופוזיה שותף של ארבעה mRNAs בניסוי זה הביא יעילות transfection 87% של כל ארבעת mRNAs בתוך כל האזורים electroplated. למרות photobleaching בתחילה מפחית את עוצמת הפלואורסצנטיות בתאים photobleached על ידי כ 95% תאים מסוימים נשארים לשחזר את יכולתם לחלק ולהביע חלבונים פלואורסצנטיים זמן קצר לאחר אלקטרופורציה.יכולת זו פוחתת על פני חמש שעות לאחר אלקטרופולציה עם זאת. קח את הזמן שלך אופטימיזציה של תנאי ההדמיה הטובים ביותר ולהמשיך להתעסק גם לאחר תחילת הסרט להיות מוכן לבצע את כל ההתאמות במידת הצורך.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

ביטוי של חלבונים ניאון ב<em&gt; Lanceolatum מיתרני הראש</em&gt; על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

באובו הזרקה תוך-וסקולרית בעוברי עוף

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...