Name: robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00
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J. W. C. 得到加拿大卫生研究所（CIHR）的支持。作者要感谢孙春祥博士协助进行试青蓝染色。

所有鼠的研究都符合相关的伦理法规，并经多伦多大学动物护理委员会和研究伦理委员会批准（协议20011930）。
1. 连字安装
注：这是一个非无菌的外科手术，可以在标准手术室进行。使用无细菌动物（此处未涵盖）要求在生物安全柜内处理、使用无菌仪器以及用牙周病原体接种口腔，以引起牙周炎的临床表现。
<ol><li>根据经批准的机构动物护理和使用?...

与使用月冠引起的牙周炎模型相关的最关键的因素是围绕保留结扎，直到牺牲或故意去除的时间。安装的生物膜保持结扎能够导致在6天内导致阿尔韦拉尔骨高度的显著损失，在11-16天期间39之间稳定下来。决定在骨质流失的最长时期之前牺牲动物受试者，使这个结扎引起的牙周炎模型更短，被选择进一步减少过早结扎的发生率，定义为在牺牲前失去结扎，使动物无法诊断。
<p ...

牙周病（PD）是一种与重大宿主发病率和经济负担相关的骨解疾病，表现为牙龈炎症和软组织附件的丧失和对受影响的牙龈1、2、3、4的骨质支持。这个过程由宿主的口腔微生物群和先天免疫系统之间的相互作用所控制。它也与其他全身炎性疾病的恶化有关，包括糖尿病、心血管疾病和癌症5，6，7，8。从历史上看，据推测，PD发病机制依赖于大量的特定细菌，如波菲洛莫纳斯牙龈9。然而，最近的证据表明，PD的微生物成分是由牙科生物膜介导的。生物膜是一个有组织的，复杂的社区，由众多微生物组成，可以存在于健康的共生和破坏性的生物发育不良状态10，11。口服生物膜通常通过防止致病菌的建立来抵抗宿主，并通过调节宿主免疫反应12、13促进理想的牙龈组织结构和功能。口腔内共体生物体与宿主免疫系统之间平衡关系的扰动可能导致组织平衡的改变，导致细菌不及PD5、10、12、13、14的标记临床和放射外观的发展。
有趣的是，建立口腔不良细菌病，虽然需要启动PD，但不足以驱动PD在所有个体，逃避宿主免疫反应的能力，颠覆微生物群之间的共生和发育不良状态15过渡。这特别突出了PD影响先天免疫系统的主要特征之一，即多态核粒细胞（PMN），或中性粒细胞，从局部和系统的角度来看，从局部和系统的角度16，17。
在人类中，PMN在健康的牙周结缔组织中以+2 x 106细胞/小时的速度从循环中招募，它们是主要白细胞种群。在这里，它们随后被从牙龈硫酸盐中排出到口腔中，作为牙龈粘液的组成部分。在PD的存在，嗜中性粒细胞在循环和口腔中显现，其中这些效应细胞具有超炎表型，导致上述破坏的牙周17，18，19，20，21，22。因此，了解 PMN 在 PD 和其他全身炎症条件中的作用至关重要。
虽然人们普遍认为慢性病与PD有相互联系，但基本机制尚未得到阐明，造成这些病态和可能致命的系统疾病的管理困难。多个实验动物模型，每个都有独特的优点和缺点，已被利用来研究PD23，24的病理生理学。特别侧重于鼠模型，有各种协议，通过它促进对PD的研究;然而，他们有几个技术和生理缺陷25，26，27，28，29，30，31。
首先，口服腹膜小鼠模型需要大量人类牙周病原体的口服接种，以产生牙龈炎症和骨质流失。此外，它一般先有一段时间的抗生素治疗，以颠覆鼠群的口腔菌群25。这种模式通常需要专门的训练来安全地进行口腔结节，只使用一小部分来自更复杂的人类口腔微生物群的牙周病原病原体，并且需要几个月才能建立腹腔骨流失。
相反，化学诱导的鼠模型利用口服三硝基苯硫酸（TNBS）或硫酸钠（DSS），这种在几个月内建立结肠炎的鼠类模型时常用的制剂诱导牙周骨流失26。基于口腔内脓肿和外脓肿的模型可用，分别涉及地膜和钙化物的鼠切口和组织。在以前的脓肿模型中，多次注射细菌，产生多个牙龈脓肿和缺乏藻类骨质流失，限制了其在PD研究中的使用。后者脓肿模型明显更容易研究口腔外部位的细菌毒性、炎症和骨吸收，从而消除对牙周和口腔微生物群27、28、29、30、31的评价。
使用牙周炎的结结诱导模型，一个编织的丝线缝合线通常围绕第二摩尔周围安装。作为替代方案，缝合材料的单一线性段可以插入第一和第二摩尔32，33之间。结扎放置的目的是促进细菌积累和在牙龈硫化物内产生肌酸，导致牙周组织炎症和破坏组织组成牙周。最值得注意的是，这种模式能够产生显着更多的阿尔韦拉尔骨流失相比，更常用的口腔口盖模型34。使口服性食样模型的使用更加复杂的是，几种小鼠菌株（即C57BL/6）对发育的卵泡骨流失具有天然的抵抗力。这也是有问题的，因为这种菌株是最常用的基于鼠的动物研究35。
马尔切桑等人、安倍和哈吉森利斯所描述的现有程序旨在简化将连字33、36放置的技术操作。不幸的是，前一个协议需要专门的3D打印设备，并具有过早结扎丢失的可能性，从而增加动物的使用和与在手术室中花费的额外时间相关的成本。此外，这两种协议只产生可用于研究的患病牙周小区域。
该技术的优点在于同时研究口腔发育不良和免疫学，这些研究控制着牙周，利用具有不同遗传背景的低成本动物，以及简单的住房和饲养方法。因此，目标应该是尽量扩大病组织的数量，并为了实践减少动物研究的原则，将动物消费减少到尽可能低的水平。这需要确保所有动物都能被纳入实验分析37。然而，应该指出的是，无论使用哪种牙周病的动物模型，没有一个单一的模型，包括人类PD病理生理学的每一个元素。
这项新协议使用大多数实验室中的仪器和材料，在多个超颌摩尔牙齿周围放置结扎。它允许足够的时间轻松而自信地安装不太可能过早发生的连字。最后，当PMN协调PD中牙周牙的销毁时，还提出了一种以类似人类的方式恢复口服中性粒细胞的新方法。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123131</td>
			<td>BV421, Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>560602</td>
			<td>PerCP-Cy5.5, Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Male Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td>8 to 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>Multiple</td>
			<td></td>
			<td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>v8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td></td>
			<td>Model 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>v10.0.8r1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Therapy Pump</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td></td>
			<td>HTP-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66118-10</td>
			<td>Germinator 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7602-A8-684</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>100mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>X-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5905-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>16% (w/v), Methanol Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>Without CaCl2 and MgCl2, 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R9759-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SS652</td>
			<td>C13 USP 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7726-A10-700</td>
			<td>#1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7727-A10-704</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>28865</td>
			<td>Photo-Zusatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodemic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td>26G X 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
			<td>20mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils

利用鼠模型研究牙周病的病理生理学的主要优点是降低了动物的成本，一系列转基因菌株，大量的分析可以在收获的软组织和硬组织上进行。然而，其中许多制度受到程序上的批评。作为替代方案，可以采用牙周病的结扎诱导模型，由非生物性口腔微生物群的局部发展和保留驱动，这种模型是快速诱导的，相对可靠。不幸的是，结扎引起的鼠期牙周炎协议的变种被隔离到牙周的重点区域，并受到安装的连体过早的外泄。这最大限度地减少了可用于后续分析的组织数量，并增加了研究所需的动物数量。该协议描述了必要的精确操作，以放置扩展的摩尔结扎，改善保留和使用一种新的冲洗技术，以恢复小鼠的口服嗜中性粒细胞与另一种方法，以减轻上述技术挑战。

提供来自幼稚的口腔冲洗样本（图3A）和发炎（图3B）的代表性流细胞学数据，该数据是结扎引起的牙周炎的次要的。还演示了从已安装的连字恢复 PMN （图 3C）。流量细胞仪通道电压经过手动校准，使用单色补偿珠进行补偿。PMN 使用概述的浇注策略38定义为 Ly6G+veF4/...

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Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

本文提出了建立涉及多个上颌骨的月牙病结扎诱导模型的协议，从而在涉及牙龈组织和骨骼的较大区域进行后续分析，并减少动物使用。还介绍了一种以类似于人类受试者的方式评估口服中性粒细胞的技术。

用于口腔中性粒细胞病评价的鼠期牙周炎的强结合诱导模型

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

此处描述的协议为研究人员提供了一种方法，以类似于人类参与者的方式研究牙周病连结诱导动物模型中的口服嗜中性粒细胞。这种技术的主要优点是增加用于后续分析的发炎金黄色组织，从而减少了动物的用量。我们能够从牙齿周围检索生物膜涂层的连结字，可以模拟局部牙周病的有效治疗。由于发炎的金吉瓦尔组织面积增加，该模型的使用可用于动物模型中牙周炎的系统性影响。熟悉使用显微手术器械和解剖显微镜，以及在处理活体动物受试者之前打结外科医生的结，是强烈建议。这种技术的视觉演示对于缩短实现熟练连字放置所需的学习曲线长度至关重要。演示这个程序的将是杰夫·查德维格，一个研究生从我的实验室。首先将鼠标定位在加热手术平台上。确保小鼠正确麻醉后，使用弹性带在开放位置稳定最大和可移动性。用棉卷支撑颈部，以保持 maxilla 的水平位置，并覆盖身体和尾部，以减轻热量损失。将手术显微镜置于口腔上所需的放大倍率和照明位置。使用分裂钳在银杏磺胺的 M1 和 M2 最大摩尔周围安装无菌 50 或更小的编织丝缝合线。将缝合线的端尾放在齿面的齿面上，并在 M2 和 M3 接触之间插入近端段。然后，将其缠绕在 M2 的桶面周围，并将其插入 M1 和 M2 的接触之间。确保缝合线两端被紧紧拉住，以驱动它到金吉瓦尔硫化物。将近近缝合线段缠绕在 M1 周围的轮廓高度以下，并将其插入 M1 和 M2 的接触之间。紧密拉紧缝合线近近的尾部，以清除所有松弛。用外科医生的结把缝合线末端绑起来，并尽可能修剪尾巴。将结放在 M1 和 M2 之间的金花磨痕中，放在最大齿形的苍白侧。至关重要的是，用于固定连字的结是安全的，并在位置，它不会激怒动物或干扰粘结。连接安装后，将鼠标从手术器械中取出，放入热灯下的清洁笼中，确保监测直到完全恢复。在每个动物主体之间的热玻璃珠消毒器中对手术器进行消毒。将每只鼠标单独安装为适当的环境浓缩设备，并允许 ad libitum 在温度和湿度控制的环境中接触过滤水和捣碎标准周，为期 7 至 11 天。当准备收集样品时，使用移液器用100微升消毒4摄氏度PBS冲洗口腔，不带钙和镁10秒。再重复冲洗两次，将每个冲洗放入每个动物相同的 15 毫升锥形无菌试管中。通过 40 微米尼龙网过滤器将每个 15 毫升管的内容物运行到 50 毫升锥形管中，然后将滤芯转移到新的 15 毫升试管中。添加 33.3 微升 16% 的半成醛，以方便样品固定。立即对样品进行涡旋，并在冰上孵育15分钟。甲状甲醛是协议中使用的最危险试剂，应使用制造商建议的建议的个人防护设备进行处理。孵育后，用PBS将管子填充至15毫升，然后在1000xg和4摄氏度的离心，5分钟。吸升液，在四摄氏度的一毫升 FACS 缓冲液中重新悬浮颗粒，并在血细胞计或自动细胞计数器上计数细胞。重复离心并吸进上经剂。然后，将细胞颗粒重新悬浮在适当体积的 FACS 缓冲液中，使每 50 微升 FACS 缓冲液中最终浓度为 50 万至 100 万细胞，然后将细胞转移到 FACS 管中。在样品的50微升中加入一微升大鼠血清和两微升抗小鼠IGG抗体。立即对样品进行涡旋，并在冰上阻挡样品20分钟。然后，将适当的抗体添加到每个样品中。漩涡，在黑暗中在冰上孵育30分钟。孵育后，用一毫升的FACS缓冲液、涡流短暂清洗样品，并在1000xg和4摄氏度的离心机中清洗5分钟。倾倒上一个液，轻轻挡住 FACS 管的开口。重复洗涤两次，然后将样品重新悬浮在 250 微升的 FACS 缓冲器中进行存储。用石蜡膜盖住管子，用铝箔包裹，在四摄氏度下储存，直到准备分析。流式膀胱学用于分析从天真小鼠的口服冲洗中恢复的嗜中性粒细胞，以及从具有连结字引起的牙周炎的小鼠中口服冲洗和恢复连体。为了评估道骨流失，从道长骨峰到水泥骨质结，为健康和结扎小鼠测量了道骨水平。然后计算测量差异。虽然没有在这里审查，组织病理学，免疫组织化学，和形态学评估的周和起骨也可以根据研究问题进行。这个模型目前正在我的实验室里用于研究口腔先天免疫系统对全身健康和疾病的影响。

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