Name: robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00
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J. W. C. cuenta con el apoyo de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR). Los autores quieren agradecer a la Dra. Chunxiang Sun por su ayuda en la realización de la tinción azul trypan.

Todos los estudios murinos cumplieron con las regulaciones éticas pertinentes y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Toronto y la Junta de ética de investigación (Protocolo 20011930).
1. Instalación de ligaduras
NOTA: Este es un procedimiento quirúrgico no estéril que se puede llevar a cabo en un quirófano estándar. El uso de animales libres de gérmenes (no cubiertos aquí) exige el manejo dentro de un gabinete de bioseg...

El elemento más crítico asociado con el uso del modelo de periodontitis inducido por la ligadura murina se centra en la retención de la ligadura hasta el momento del sacrificio o la eliminación intencional. La ligadura biopelícula-retentiva instalada es capaz de inducir una pérdida significativa de la altura ósea alveolar en tan solo 6 días, estancando entre el período de 11-16 días39. La decisión de sacrificar a los sujetos animales antes del período máximo de pérdida ósea, lo que ...

La enfermedad periodontal (PD) es una afección osteolítica asociada a la morbilidad significativa del huésped y la carga económica, que se manifiesta por inflamación gingival y pérdida tanto de la unión de tejidos blandos como de soporte óseo para la dentición afectada1,2,3,4. Este proceso se rige por interacciones entre la microbiota oral y el sistema inmunitario innato del huésped. También se asocia con la exacerbación de otras enfermedades inflamatorias sistémicas incluyendo diabetes, enfermedades cardiovasculares, y el cáncer5,6,7,8. Históricamente, se hipotetizó que la patogénesis PD depende de grandes cantidades de bacterias específicas como Porphyromonas gingivalis9. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que el componente microbiano de la DP está mediado por el biofilm dental. El biofilm es una comunidad organizada y compleja de numerosos microorganismos que pueden existir en estados simbióticos sanos y destructivos10,11. El biofilm oral normalmente ofrece resistencia al huésped al prevenir el establecimiento de focos de bacterias patógenas y promueve la estructura y función ideal del tejido gingival a través de la regulación de la respuesta inmune del huésped12,13. Las perturbaciones de la relación de equilibrio entre los organismos comensales dentro de la cavidad oral y el sistema inmunitario huésped pueden dar lugar a alteraciones en la homeostasis tisular, lo que resulta en disbacteriosis y al desarrollo de las apariencias clínicas y radiográficas distintivas de PD5,10,12,13,14.
Curiosamente, el establecimiento de una disbacteriosis oral, si bien es necesario para el inicio de la DP, no es suficiente para conducir la DP en todos los individuos, eludiendo hacia la capacidad de la respuesta inmune del huésped para subvertir la transición de la microbiota entre los estados simbióticos y disbióticos15. Esto pone un foco particular en los medios a través de los cuales la DP influye en uno de los principales caracteres del sistema inmunitario innato, a saber, el granulcito polimorfonuclear (PMN), o neutrófilo, desde perspectivas locales y sistémicas16,17.
En los seres humanos, las PMN se reclutan de la circulación a una tasa de 2 x 106 células/h en tejidos conectivos periodontales sanos, donde son la población predominante de leucocitos. Aquí, posteriormente son expulsados del sulcus gingival a la cavidad oral como un componente del líquido crevicular gingival. En presencia de DP, la neutrofilia se manifiesta dentro de la circulación y cavidad oral, donde estas células efectoras poseen un fenotipo hiperinflamatorio que conduce a la mencionada destrucción del periodontium17,18,19,20,21,22. Por lo tanto, comprender el papel de las PMN en la DP y otras condiciones inflamatorias sistémicas es de suma importancia.
Aunque es ampliamente aceptado que las enfermedades crónicas están vinculadas recíprocamente a los datos sobre el rendimiento, los mecanismos subyacentes aún no se han aclarado, lo que contribuye a las dificultades en el manejo de estas condiciones sistémicas morbosas y potencialmente mortales. Múltiples modelos animales experimentales, cada uno con ventajas y desventajas únicas, se han utilizado para estudiar la fisiopatología de PD23,24. Centrándose específicamente en los modelos murinos, existen una variedad de protocolos a través de los cuales se facilita el estudio de los datos sobre el rendimiento; sin embargo, poseen varias deficiencias técnicas y fisiológicas25,26,27,28,29,30,31.
En primer lugar, el modelo de ratón gavage oral requiere numerosas inoculaciones orales de patógenos periodontales humanos para generar inflamación gingival y pérdida ósea. Además, generalmente está precedido por un período de tratamiento antibiótico para subvertir la flora oral commensal25. Este modelo a menudo requiere entrenamiento especializado para realizar con seguridad el gavage oral, utiliza sólo una pequeña fracción de patógenos periodontales del microbioma oral humano más complejo, y requiere varios meses para establecer la pérdida ósea alveolar.
Por el contrario, los modelos murinos inducidos químicamente utilizan la administración oral de ácido sulfónico de trinitrobenceno (TNBS) o sulfato de dextrano sódico (DSS), agentes comúnmente utilizados en el establecimiento de modelos murinos de colitis durante un período de varios meses para inducir la pérdida ósea periodontal26. Están disponibles modelos intraorales y extraorales basados en abscesos, que involucran los incisivos murinos y tejidos del dorso, así como calvario, respectivamente. En el antiguo modelo de absceso, se administran varias inyecciones de bacterias, creando múltiples abscesos gingivales y una escasez de pérdida ósea alveolar, limitando su uso en el estudio de la DP. Los últimos modelos de absceso son significativamente más aptos para estudiar la virulencia bacteriana, la inflamación y la resorción ósea en sitios fuera de la cavidad oral, lo que elimina la evaluación del periodontium y el microbioma oral27,28,29,30,31.
Utilizando el modelo de periodontitis inducido por la ligadura, comúnmente se ha instalado una sutura de seda trenzada circunferencialmente alrededor del segundo molar. Como alternativa, se puede insertar un único segmento lineal de material de sutura entre el primer y segundo molares32,33. El objetivo de la colocación de la ligadura es facilitar la acumulación bacteriana y generar disbiosis dentro del sulci gingival, lo que resulta en inflamación del tejido periodontal y destrucción de los tejidos que componen el periodontium. Más notablemente, este modelo es capaz de producir significativamente más pérdida ósea alveolar en comparación con el más comúnmente utilizado gavage oral modelo34. Complicando aún más el uso del modelo de gavage oral es la resistencia natural de varias cepas de ratones (es decir, C57BL/6) al desarrollo de la pérdida ósea alveolar. Esto también es problemático, ya que esta cepa es la más utilizada en la investigación animal basada en murinos35.
Los procedimientos existentes descritos por Marchesan et al. y Abe y Hajishengallis fueron ideados para simplificar el acto técnico de colocación de la ligadura33,36. Desafortunadamente, el antiguo protocolo requiere equipos especializados impresos en 3D y poseen el potencial de pérdida prematura de ligaduras, aumentando así el uso de animales y los costos asociados con el tiempo adicional invertido en el quirófano. Además, ambos protocolos generan sólo pequeñas regiones del periodontium enfermo disponiblepara un estudio.
Las ventajas que se centran en esta técnica se basan en el estudio simultáneo de la disbiosis oral y la inmunología que rigen el periodontium, la utilización de animales de bajo costo con diversos orígenes genéticos, y prácticas simples de vivienda y cría. Como tal, los objetivos deben ser maximizar los volúmenes de tejido enfermo y, en los intentos de practicar los principios de reducción de la investigación animal, reducir el consumo de animales a un nivel lo más bajo posible. Esto requiere garantizar que todos los animales puedan ser incluidos en los análisis experimentales37. Sin embargo, cabe señalar que no importa qué modelo animal de enfermedad periodontal se utilice, no hay un solo modelo que abarque todos los elementos de la fisiopatología humana de la PD.
Este nuevo protocolo emplea la colocación de una ligadura alrededor de múltiples dientes molares maxilares utilizando instrumentación y materiales que se encuentran en la mayoría de los laboratorios. Permite una cantidad suficiente de tiempo para instalar fácil y seguramente una ligadura que es poco probable que se avule prematuramente. Por último, a medida que las PMN coordinan la destrucción del periodontio en la DP, también se presenta una metodología novedosa para recuperar neutrófilos orales de una manera análoga a los seres humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>123131</td>
			<td>BV421, Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>560602</td>
			<td>PerCP-Cy5.5, Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Male Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td>8 to 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td>Multiple</td>
			<td></td>
			<td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>v8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td></td>
			<td>Model 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>v10.0.8r1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Therapy Pump</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td></td>
			<td>HTP-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>66118-10</td>
			<td>Germinator 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7602-A8-684</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>100mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>X-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5905-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>16% (w/v), Methanol Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>Without CaCl2 and MgCl2, 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R9759-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SS652</td>
			<td>C13 USP 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7726-A10-700</td>
			<td>#1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter Forceps</td>
			<td>Almedic</td>
			<td>7727-A10-704</td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Dissecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>28865</td>
			<td>Photo-Zusatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodemic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td>26G X 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
			<td>20mg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils

Las principales ventajas de estudiar la fisiopatología de la enfermedad periodontal utilizando modelos murinos son el menor costo de los animales, la variedad de cepas modificadas genéticamente, el gran número de análisis que se pueden realizar en los tejidos blandos y duros cosechados. Sin embargo, muchos de estos sistemas están sujetos a críticas de procedimiento. Como alternativa, se puede emplear el modelo inducido por la ligatura de la enfermedad periodontal, impulsado por el desarrollo localizado y la retención de un microbioma oral disbiótico, que es rápidamente inducido y relativamente confiable. Desafortunadamente, las variantes del protocolo de periodontitis murina inducida por ligaduras están aisladas en regiones focales del periodontium y sujetas a la avulsión prematura de la ligadura instalada. Esto minimiza la cantidad de tejido disponible para análisis posteriores y aumenta el número de animales necesarios para el estudio. Este protocolo describe las manipulaciones precisas necesarias para colocar ligaduras molares extendidas con una mejor retención y el uso de una técnica de enjuague novedosa para recuperar neutrófilos orales en ratones con un enfoque alternativo que mitiga lo antes mencionado desafíos técnicos.

Se proporcionan datos representativos de citometría de flujo a partir de muestras de enjuague oral de una ingenua(Figura 3A)e inflamadas(Figura 3B)cavidad oral murina secundaria a la periodontitis inducida por ligaduras. También se demuestra la recuperación de las PMN de una ligadura instalada(Figura 3C). Las tensiones de canal del citómetro de flujo se calibraron manualmente, y...

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Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Este artículo presenta un protocolo para establecer un modelo inducido por ligaduras de periodontitis murina que involucre múltiples molares maxilares, lo que resulta en áreas más grandes del tejido gingival y hueso involucrados para su posterior análisis, así como un menor uso de animales. También se describe una técnica para evaluar a los neutrófilos orales de una manera análoga a los sujetos humanos.

Modelo robusto inducido por la ligatura de la periodontitis murina para la evaluación de los neutrófilos orales

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

El protocolo descrito aquí proporciona a los investigadores un método para estudiar a los neutrófilos orales dentro de un modelo animal inducido por ligaduras de la enfermedad periodontal de una manera análoga a los participantes humanos. La principal ventaja de esta técnica se destaca por el aumento del volumen de tejidos gingivares inflamados disponibles para su posterior análisis, lo que reduce el uso de animales. Nuestra capacidad para recuperar las ligaduras recubiertas de biopelículas alrededor de los dientes permite la simulación de un tratamiento eficaz de una enfermedad periodontal localizada.El uso de este modelo podría aplicarse en el estudio de los efectos sistémicos de la periodontitis en un modelo animal, debido al aumento de las áreas de los tejidos gingivares inflamados. Se recomienda en gran medida la familiarización con el uso de instrumentos microquirúrgicos y microscopios de disección, así como la atar los nudos del cirujano antes de manipular sujetos animales vivos. La demostración visual de esta técnica es fundamental para reducir la longitud de la curva de aprendizaje necesaria para lograr una colocación de ligadura competente.Demostrando el procedimiento estará Jeff Chadwig, un estudiante graduado de mi laboratorio. Comience colocando el ratón en una plataforma quirúrgica calentada. Después de asegurarse de que el ratón está correctamente anestesiado, estabilice el maxilar y la mandíbula en posición abierta utilizando bandas elásticas.Prope el cuello con un rollo de algodón para mantener el maxilar en una posición horizontal y cubrir el cuerpo y la cola para mitigar la pérdida de calor. Coloque el microscopio quirúrgico en el aumento y la iluminación deseados sobre la cavidad oral. Utilice fórceps de astilla para instalar una sutura de seda trenzada estéril de 50 o más pequeña alrededor de los molares maxilares M1 y M2 dentro del sulcus gingival.Coloque la cola distal de la sutura en el lado palatal de la dentición e inserte el segmento proximal entre el contacto de M2 y M3. A continuación, envuélvalo alrededor de la superficie bucal de M2 e insértelo entre el contacto de M1 y M2. Asegúrese de que ambos extremos de la sutura se tiran firmemente para conducirlo hasta el sulcus gingival. Envuelva el segmento de sutura proximal alrededor de M1 por debajo de su altura de contorno e insértelo entre el contacto de M1 y M2. Tire de la cola proximal de la sutura firmemente para eliminar toda holgura. Ate los extremos de la sutura con el nudo de un cirujano y recorte las colas de la forma más ordenada posible.Coloque el nudo en la abrazadera gingival entre M1 y M2 en el lado palatal de la dentición maxilar. Es fundamental que el nudo utilizado para asegurar la ligadura esté seguro y en posición donde no irritará al animal ni interferirá con la masticación. Después de la instalación de la ligadura, retire el ratón del aparato quirúrgico y colóquelo en una jaula limpia bajo una lámpara de calor, asegurándose de monitorearlo hasta que esté completamente recuperado.Esterilice los instrumentos quirúrgicos en el esterilizador de perlas de vidrio caliente entre cada sujeto animal. Alberge individualmente cada ratón con el enriquecimiento ambiental adecuado y permita el acceso ad libitum al agua filtrada y puré de comida estándar en un ambiente controlado por temperatura y humedad durante siete a 11 días. Cuando esté listo para recoger muestras, utilice una pipeta para enjuagar la cavidad oral con 100 microlitros de PBS de cuatro grados esterilizados sin calcio y magnesio durante 10 segundos.Repita el enjuague dos veces más, colocando cada enjuague en el mismo tubo de ensayo estéril cónico de 15 mililitros para cada animal. Ejecute el contenido de cada tubo de 15 mililitros a través de un filtro de malla de nylon de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros, y transfiera el filtrado a un nuevo tubo de ensayo de 15 mililitros. Añadir 33,3 microlitros de 16%paraformaldehído para facilitar la fijación de la muestra.Vórtice las muestras inmediatamente e incubarlas sobre hielo durante 15 minutos. El paraformaldehído es el reactivo más peligroso empleado en el protocolo y debe ser manipulado con el equipo de protección personal recomendado aconsejado por el fabricante. Después de la incubación, llene el tubo a 15 mililitros con PBS y luego centrifugarlo a 1000xg y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Aspirar el sobrenadante, volver a suspender el pellet en un mililitro de tampón FACS a cuatro grados centígrados y contar las células en un hemocitoómetro o contador de células automatizado. Repita la centrifugación y aspire el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender el pellet celular en un volumen apropiado de búfer FACS para una concentración final de 500.000 a 1 millón de células por cada 50 microlitros de búfer FACS y transfiera las células al tubo FACS.Agregue un microlitro de suero de rata y dos microlitros de anticuerpo IGG antiratón a 50 microlitros de la muestra. Vórtice la muestra inmediatamente y bloquearla sobre hielo durante 20 minutos. A continuación, añada los anticuerpos adecuados a cada muestra.Vórtice e incubar sobre hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, lave las muestras con un mililitro de tampón FACS, vórtice brevemente y centrífuga durante cinco minutos a 1000xg y cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante y bloquee suavemente la abertura del tubo FACS.Repita el lavado dos veces y, a continuación, vuelva a suspender las muestras en 250 microlitros de búfer FACS para su almacenamiento. Cubra los tubos con película de parafina, envuélvalos en papel de aluminio y guárdelos a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para analizar. La citometría de flujo se utilizó para analizar los neutrófilos recuperados de un enjuague oral de un ratón ingenuo, así como un enjuague oral y ligadura recuperada de un ratón con periodontitis inducida por ligadura.Para evaluar la pérdida ósea alveolar, se midieron los niveles óseos alveolares desde la cresta ósea alveolar hasta la unión de cementoenamel para ratones sanos y ligados. Luego, se calcularon las diferencias de medición. Aunque no se revisa aquí, también se puede llevar a cabo una evaluación histopatológica, inmunohistoquímica y morfométrica del periodontium y el hueso alveolar dependiendo de la cuestión de la investigación.Este modelo se utiliza actualmente en mi laboratorio para estudiar los efectos del sistema inmunitario innato oral en la salud y enfermedad sistémicas.

Research

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